肠缺血再灌注损伤诱导Cajal间质细胞凋亡的机制研究

车 轩，郭依然，赵国杰，乔光超，吴国华，冯运章

(邯郸市中心医院 1.普外七科；2.教学科,河北 邯郸056001)

小肠是最易受缺血再灌注损伤的器官之一，在失血性休克或小肠移植中极易受到肠缺血再灌注损伤[1]。Cajal间质细胞在胃肠运动中起重要调节作用，其中一个亚群位于肌间神经丛(ICC-MY)水平，发挥着起搏细胞的作用，在小肠中产生和传播慢波[2]。另一个与深肌丛(ICC-DMP)密切相关，在肠道神经系统对胃肠道平滑肌的输入中起中介作用[3]。受体酪氨酸激酶(Kit)，被认为是Cajal间质细胞的发育、分化和功能维持所必需的。最近的研究还表明，Kit表达下调可能与小肠缺血再灌注损伤引起的胃肠动力障碍有关[4]。其他研究也显示，肠道手术操作和胃肠道疾病如肠梗阻后Kit免疫阳性的丧失，这可能是肠动力功能障碍相关的潜在机制之一[5]。然而，在缺血再灌注损伤后，在肝脏、肾脏、肠道和肺中可观察到明显的细胞凋亡，但尚不清楚Cajal间质细胞是否也参与了肠缺血再灌注损伤。本研究探讨了肠缺血再灌注损伤是否能诱导Cajal间质细胞凋亡及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只6-8周龄雄性豚鼠，体质量300-350 g，购于河北医科大学生物医学工程中心，生产许可证号：SCXK(冀)2019-001。所有豚鼠均饲养在SPF级动物房中,室温(23±2)℃，相对湿度(40%-70%)，昼夜循环12 h,豚鼠可自由进食、饮水，适应性喂养一周。

1.2 肠缺血手术方法

豚鼠在麻醉后进行手术，取正中切口剖腹，分别结扎右结肠动脉降支与回肠动脉升支之间、回肠降支与最后一条回肠动脉之间、肠系膜上动脉近端和远端空肠动脉之间的血管弓，阻断侧支血流。同时，为了阻断肠壁内的侧支循环，在空肠和回肠末端加用血管微夹，使其与血管拱部处于相同的结扎水平。然后用血管夹闭右侧结肠动脉近端的肠系膜上动脉，右结肠动静脉和回结肠动静脉也进行闭塞。在计划的缺血时间结束后，取出血管微夹，通过肠颜色由白色变为粉红色和肠系膜动脉搏动恢复来确认小肠的血液再灌注。将小肠回纳到腹部，切口用两层连续的3-0丝线缝合。

1.3 分组

将40只豚鼠分为实验组和假手术Sham组。实验组豚鼠解除缺血后分别再灌注6 h(6 h 组，n=8)、12 h(12 h 组，n=8)、7 d(7 d组，n=8)和14 d(14 d组，n=8)，分别在肠缺血手术结束后，再灌注的第6 h、12 h、7 d、14 d处死。假手术Sham组(Sham组,n=8)：除血管夹闭外，其他处理方式同前。豚鼠处死后取回肠组织进行实验。

1.4 病理组织学检测

切除豚鼠回肠，用PBS冲洗肠道内容物。将小肠用丙酮充气30 min，沿肠系膜切开取出黏膜，在解剖显微镜下制备含有ICC-MY的纵向平滑肌层和围绕深肌丛的与Cajal间质细胞相关的环状平滑肌层，进行显微镜下Cajal间质细胞观察。将肠组织固定在4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋后，取4μm切片，苏木精-伊红染色，在光镜下进行肠黏膜形态观察。

1.5 TUNEL凋亡检测

肠组织用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗两次30 min，然后用0.1%Triton X-100在冰上处理20 min。用含有45 μl标记液和5 μl酶液的TUNEL反应缓冲液在37℃黑暗环境中孵育1 h。然后用PBS清洗切片三次，每次15 min，以去除未结合的荧光素-dUTP。立刻在荧光显微镜下观察，激发波长在450-500 nm之间。

1.6 ELISA检测

PBS冲洗豚鼠肠组织，称重、剪碎。加入含蛋白酶抑制剂的预冷PBS进行匀浆。吸取匀浆液到离心管，4℃、5 000 g条件下离心10 min，取上清，-80℃保存，避免反复冻融。采用ELISA法检测TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23水平，按照试剂盒说明进行操作。

1.7 Western blot检测

肠组织匀浆，然后用BioRad蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白质样品在8%-10%的SDSPAGE上电泳后转移到硝酸纤维素膜上，5%的脱脂牛奶封闭。将膜与STAT2一抗(1∶1 000稀释，Abcam公司)、JAK2一抗(1∶1 000稀释，Abcam公司)、Bcl2一抗(1∶1 000稀释，Abcam公司)、Bax一抗(1∶1 000稀释，Abcam公司)在4℃共同孵育过夜，然后与二抗反应，用增强型化学发光试剂显影印迹条带，并用BioRad成像系统检测，其中条带信号强度用Quantity One软件进行定量分析。

1.8 统计学分析

所有数据应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，多组间比较采用多因素方差检验，两两比较采用LSD法进行。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组豚鼠肠道黏膜损伤比较

Sham组豚鼠肠上皮结构完整，未见炎症细胞浸润。7 h组豚鼠可见肠上皮结构部分破坏，可见部分肠皮上细胞脱落及小溃疡形成。14 h组豚鼠肠上皮结构被进一步破坏，可见大量溃疡及明显上皮细胞脱落。7 d组及14 d组上皮细胞仍有损伤，但可见炎症明显缓解，上皮结构部分恢复。见图1。

图1 各组豚鼠肠黏膜病理检查结果(×400)

2.2 Cajal间质细胞形态的变化

与Sham组相比，在6 h组肠道细胞网络基本完整；12 h组豚鼠肠道细胞突起的密度和厚度均显著降低。再灌注7 d、14 d后，肠道细胞网络部分恢复，且再灌注恢复时间越长，细胞网络越完整，在第14 d时，细胞网络已基本恢复正常。见图2。

图2 各组Cajal间质细胞形态变化(×200)

2.3 Cajal间质细胞凋亡检测

TUNEL法检测肠道细胞凋亡。在Sham组中，没有检测到明显的凋亡细胞。6 h组、12 h组、7 d组、14 d组的凋亡细胞比例分别为(6.84±0.89)%、(48.6±6.85)%、(22.14±4.82)%、(9.64±1.41)%，差异具有统计学意义(P<0.05)。12 h组豚鼠肠道细胞的凋亡细胞比例显著最高，随着康复时间的延长，7 d组、14 d组肠道凋亡细胞逐渐下降。见图3。

图3 各组肠道细胞TUNEL凋亡检测(×200)

2.4 各组豚鼠肠组织中炎症因子水平比较

ELISA检测结果显示，12 h组豚鼠肠组织中的炎症因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表达水平达到峰值，显著高于其他组豚鼠(P<0.05)。与12 h组相比，7 d组及14 d组豚鼠肠道炎症因子水平逐渐下降；14 d组豚鼠肠道的IL-12、IL-23的表达水平与Sham组无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组豚鼠肠组织中炎症因子水平比较

2.5 Western blot检测JAK2/STAT2信号通路相关蛋白表达

Western blot检测显示，与Sham组相比，6 h组豚鼠肠组织中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)。12 h组豚鼠肠组织STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平进一步降低(P<0.05)，而7 d组、14 d组豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐渐升高，Bax水平下降(P<0.05)。见图4。

图4 Western blot检测JAK2/STAT2信号通路相关蛋白表达

3 讨论

近年来，随着免疫抑制剂和术后处理方案的改进，小肠移植已成为短肠综合征患者在全肠外营养治疗中出现危及生命的并发症的首选治疗方法。然而，缺血再灌注损伤是小肠移植的一个重要限制因素，因为小肠是最易受缺血影响的器官之一。小肠移植物的损伤不仅发生在缺血期间，也发生在再灌注后。小肠的缺血再灌注损伤可引起黏膜水平的显著改变，黏膜屏障功能受损，进而导致细菌易位和内毒素血症增加[6]。这可能会促进严重的系统性、多器官反应。因此，控制移植物缺血再灌注损伤是小肠移植成功的关键。虽然小肠缺血再灌注损伤的详细机制尚不清楚，但各种介质，如细胞因子(TNF-α和IL-23)、活性氧中间体、血小板活化因子和一氧化氮等，已被证实与内毒素血症和小肠再灌注损伤有关[7]。在这些介质中，炎症细胞因子TNF-α和IL-23被认为在炎症反应的早期阶段起着重要作用。本研究通过ELISA检测发现，12 h组豚鼠肠组织中的炎症因子，包括TNF-α、乳酸、IL-12、IL-23的表达水平达到峰值。与12 h组相比，7 d组及14 d组豚鼠肠道炎症因子水平逐渐下降；14 d组豚鼠肠道的IL-12、IL-23的表达水平与Sham组无明显差异。IL-12在实验动物中可引起血流动力学休克和组织损伤。最近研究表明，TNF-α和IL-12在肝脏和心脏的缺血再灌注损伤中起重要作用[8]。细胞因子抑制剂FR 167653被证明能抑制脂多糖刺激的人单核细胞产生的TNF-α，并能通过抑制TNF-α的产生来改善内毒素诱导的休克和弥散性血管内凝血[9]。

本研究发现肠缺血再灌注损伤后Kit阳性的Cajal间质细胞凋亡、数量减少，但随着肠灌注时间的延长，Cajal间质细胞数量明显恢复。缺血再灌注损伤可导致胃肠功能障碍，如胃肠道转运延迟，移行运动复合体改变，在体外可导致平滑肌细胞的机械收缩减少[10]。豚鼠肠缺血再灌注损伤模型显示Kit阳性的Cajal间质细胞的丢失伴随着自发性机械收缩的减弱，这种收缩可能是由Cajal间质细胞驱动的。因此，有研究者认为Cajal间质细胞在缺血再灌注引起的运动障碍中起核心作用。本研究发现，在肠缺血再灌注豚鼠模型中，ICC-MY中Kit阳性细胞的数量减少了50%，Kit表达丢失可能是运动障碍相关的潜在机制之一。另一些研究者根据Kit信号阻断实验，推测Kit的丢失可能导致Cajal间质细胞向平滑肌细胞表型的转分化[11]。在肝脏、肾脏、心脏以及肠缺血再灌注损伤的动物模型中，细胞凋亡通常存在于组织[12]。本研究采用TUNEL法证实了肠道缺血再灌注造成了肠细胞的凋亡，这可能也是导致肠功能障碍的原因之一。

缺血再灌注损伤可造成线粒体Ca2+超载和活性氧大量释放，导致线粒体严重的结构和功能破坏，是组织细胞缺血再灌注损伤的主要原因[13]。JAK2/STAT2信号通路具有抑制线粒体通透性转化孔开放、抑制内质网应激反应和促进核因子NF-E2相关因子2激活转位从而起到抗氧化及抗细胞凋亡等作用，在缺血再灌注损伤中起着重要保护作用[14]。本研究发现与Sham组相比，6 h组豚鼠肠组织中STAT2、JAK2、Bcl2蛋白表达水平显著下降，Bax蛋白水平明显升高，而7 d组、14 d组豚鼠的STAT2、JAK2、Bcl2蛋白水平逐渐升高，Bax水平下降(P<0.05)。这表明，缺血再灌注损伤导致的组织细胞凋亡，使Bcl2/Bax蛋白比例失衡，使JAK2/STAT2信号通路活性被抑制。但随着再灌注时间延长，豚鼠的肠道细胞稳态得到恢复，JAK2/STAT2信号通路活性得到一定程度缓解，这与组织病理学所观察到的结果一致。

综上所述，肠缺血再灌注损伤可导致Cajal间质细胞凋亡、数量减少，这可能与抑制JAK2/ STAT3信号通路的活性有关。