10种治疗结肠炎的中药单体筛选及疗效评估

董 雪，刘久茜，蔡佳培，张文龙，张乃生，曹永国

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，是一种复发性肠道症疾病[1]。近年来，IBD的发病率在许多国家呈上升趋势，已被公认为是一种全球性疾病[2]。UC是IBD的主要亚型，是一种以慢性炎症反应和肠黏膜上皮损伤为特征的非特异性肠道炎症性疾病[3-4]。近年来，UC在人和动物的发病率不断增加[5-7]。动物的UC是指肠黏膜的急性炎症，临床以消化紊乱、腹痛、腹泻、发热为特征[8]。

目前，暂时还没有彻底治愈UC的药物，但根据疾病的严重程度可以选择手术或药物进行治疗[9]。临床上用于治疗UC的药物主要有氨基水杨酸类、柳氮磺吡啶和皮质类固醇、免疫抑制剂和单克隆抗体等[10]。这些药物在UC的治疗过程中效果很明显，但这些药物的长期或大剂量使用可能会导致更加严重的不良反应，如腹痛、肾损伤、肝毒性和血液疾病[11]。因此，有学者建议使用一些药用植物和各种天然提取物作为这些药物的替代品[12-13]。

苍术素、荷叶碱、龙脑[14]、葛根素[15]、鱼腥草素钠[16]、山奈酚、芝麻素[17]、王浆酸、广藿香酮[18]和甘草苷分别是从菊科植物茅苍术、睡莲科植物荷叶、樟科植物龙脑樟、豆科植物野葛的干燥根、三白草科蕺菜属植物鱼腥草、姜科植物山柰、胡麻科植物芝麻[17]、蜂王浆、唇形科植物广藿香和豆科甘草属植物甘草中提取的天然化合物，均具有潜在的抗炎和抗肿瘤等作用。然而，对于这些天然化合物是否对缓解UC有作用尚未见相关报道。因此，本试验拟使用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的UC小鼠作为动物模型，来探究不同天然化合物是否对UC有治疗的效果，以期为防治动物结肠炎的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂苍术素(HPLC≥98%,DST200806-004)、荷叶碱(HPLC≥98%,DST200320-051)、龙脑(HPLC≥98%,DST200406-062)、葛根素(HPLC≥98%,DST191001-002)、鱼腥草酸钠(HPLC≥98%,DST200601-201)、山奈酚(HPLC≥98%,DST200829-056)、甘草苷(HPLC≥98%,DST191027-009)、芝麻素(HPLC≥98%,DST200605-029)、广藿香酮(HPLC≥98%,DST200407)等均购自成都德斯特生物技术有限公司(中国成都)；王浆酸(HPLC≥98%,DSTDW003601)购自成都曼斯特生物技术有限公司(中国成都)；DSS(MK36 000～50 000)购自MP Biomedical公司(美国加利福尼亚州欧文市)。

1.2 试验动物及分组60只雄性C57BL/6小鼠(21～23 g，辽宁长生生物技术有限公司)。试验前，所有小鼠在(24±1)℃条件下至少适应1周，并确保小鼠自由进食和饮水。所有程序均按照吉林大学实验动物护理和使用指南进行，并经吉林大学动物伦理委员会批准。将小鼠随机分为12组，每组5只：对照组、模型组、苍术素组、荷叶碱组、龙脑组、葛根素组、鱼腥草素钠组、山奈酚组、甘草苷组、芝麻素组、王浆酸组和广藿香酮组。在适应1周后，除对照组外所有试验组小鼠第1～5天用含有2.5% DSS的饮用水代替正常饮用水诱发结肠炎。根据文献报道剂量，除对照组和DSS组外，其他每组每日分别口服苍术素14 mg/kg[19]、荷叶碱20 mg/kg[20]、龙脑25 mg/kg[14]、葛根素30 mg/kg[21]、鱼腥草素钠50 mg/kg[22]、山奈酚50 mg/kg[23]、甘草苷20 mg/kg[24]、芝麻素50 mg/kg[25]、王浆酸100 mg/kg[26]、广藿香酮20 mg/kg[27]。第8天安乐死小鼠，测量结肠长度，采集结肠图片、组织样本用于后续分析。

1.3 疾病活动指数(disease activity index,DAI)和结肠长度在DSS处理期间，每天测量小鼠体质量、粪便状态和粪便中的血液，以计算小鼠的DAI。DAI定义为体质量减轻评分、粪便特征评分和血便分数的平均值，用于评估结肠炎的严重程度。第8天，在处死小鼠后，去除多余的结肠组织，并测量从盲肠到肛门的结肠长度。

1.4 组织学评估处死小鼠后，将从小鼠分离的结肠组织固定在4%甲醛溶液中，然后包埋在石蜡中。制备切片(4 μm)并用二甲苯脱蜡。随后，用苏木精和伊红(HE)对切片进行染色，并根据炎症细胞浸润和上皮损伤进行组织学评估。

1.5 结肠组织中细胞因子水平的测定将结肠组织在10倍体积的冰冷PBS中匀浆，然后4℃、12 000 r/min 离心10 min。使用小鼠ELISA试剂盒按照说明检测小鼠结肠细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10水平。

2 结果

2.1 不同中药单体对DSS诱导小鼠临床症状的影响在本试验中，研究了不同中药单体对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。在UC发病过程中，体质量和DAI评分是判断其严重程度的重要指标。DAI评分包括粪便黏稠度和粪便血液的综合评分。如图1A，C所示，与对照组相比，DSS组小鼠体质量明显减轻，龙脑、葛根素、鱼腥草素钠、山奈酚、芝麻素、王浆酸、广藿香酮和甘草苷组小鼠体质量减轻，且与DSS组未有显著差异，但苍术素和荷叶碱处理，使小鼠体质量减轻程度明显降低。如图1B所示，与对照组小鼠相比，DSS组小鼠的DAI评分显著升高。与DSS组小鼠相比，龙脑、葛根素、鱼腥草素钠、山奈酚、芝麻素、王浆酸、广藿香酮和甘草苷处理组小鼠DAI评分并未有显著区别。但苍术素和荷叶碱处理的小鼠DAI评分显著降低。

A.体质量变化；B.DAI评分；C.体质量增加量。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。下同

2.2 不同中药单体对DSS诱导小鼠的结肠长度的影响小鼠结肠长度变化如图2所示。结肠收缩是DSS诱导的结肠炎的重要症状，结肠长度可以反映炎症的严重程度。DSS处理组结肠缩短程度增加，苍术素和荷叶碱治疗组的结肠缩短程度显著降低，但其他药物治疗组的结肠与DSS组相比并无显著性差异。

图2 不同中药单体对DSS诱导的UC小鼠结肠长度的影响

2.3 不同中药单体对DSS诱导的结肠组织学损伤的影响如图3所示，结肠组织的病理变化非常显著。病理组织学观察结果表示，对照组小鼠结肠组织形态清晰，结构十分完整，无明显损伤，肠上皮细胞形态清晰。然而，模型组的结肠病变程度非常严重，包括炎性细胞浸润、杯状细胞缺乏和溃疡。苍术素和荷叶碱治疗后结肠损伤程度明显低于模型组组，上皮细胞破坏程度降低，炎症细胞浸润较少，杯状细胞丢失情况减轻，隐窝消失减少。但其他药物治疗组结肠损伤程度严重，与模型组无明显区别。因此，上述结果表明苍术素和荷叶碱治疗可改善DSS诱导的小鼠结肠炎的组织学损伤。

A.对照组组织病理学变化；B～K.苍术素、荷叶碱、龙脑、葛根素、鱼腥草素钠、山奈酚、甘草苷、芝麻素、王浆酸和广藿香酮处理组组织病理学变化；L.模型组组织病理学变化

2.4 不同中药单体对DSS诱导的结肠组织中炎性细胞因子的影响为了探究不同中药单体对结肠组织中细胞因子的影响，测试了结肠组织中炎性细胞因子的水平，结果如图 4 所示。DSS 组的促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-1β 水平显着高于对照组。苍术素和荷叶碱处理后，小鼠结肠组织中TNF-α和IL-1β水平显著降低。然而，与DSS组相比，苍术素和荷叶碱治疗的小鼠结肠组织中IL-10水平显著升高。这些结果表明，苍术素和荷叶碱可以调节结肠组织中炎性细胞因子的水平。

2.5 苍术素、荷叶碱对LPS刺激的原代腹腔巨噬细胞炎症水平的影响为了进一步验证初筛出的苍术素和荷叶碱2种中药单体的抗炎作用，用 LPS 刺激了原代腹腔巨噬细胞，结果如图5所示。与对照组相比，LPS组TNF-α表达水平明显升高。苍术素和荷叶碱处理后，TNF-α的表达水平明显低于LPS组。苍术素和荷叶碱治疗后抗炎因子IL-10的表达水平明显高于LPS组。 这些结果表明，苍术素和荷叶碱可以降低LPS刺激的原代腹腔巨噬细胞的炎症水平。

A.结肠组织中的 TNF-α 水平；B.结肠组织中IL-1β的水平；C.结肠组织中IL-10的水平

3 讨论

UC是一种慢性、复发性肠道炎症性疾病，在发达国家发病率较高。目前,对该病的治疗仍以抗炎、抗免疫药物为主，大多数UC的治疗药物主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂，但这些药物临床上治疗效果不理想，且存在严重的不良反应。因此，找到一种更为合理且有效的替代疗法迫在眉睫。中医药在防治肠道疾病方面具有明显的优势，如调节机体免疫力、减少肠道菌群紊乱、毒副作用小等，如红景天苷能有效改善DSS介导的小鼠UC的临床表现[28]。

苍术素是从菊科植物苍术或北苍术的干燥根茎提取的一种物质，具有降血糖、利尿、促进胃排空、抗炎、抗肿瘤等药理活性。研究表明，苍术素可以通过抑制NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体和Toll样受体4(TLR4)信号通路减轻由脂多糖诱导的急性肺损伤[29]。荷叶碱是荷叶中的一种阿朴啡型生物碱，为荷叶中的主要降脂活性成分,用晒干粉碎的荷叶为原料，采用纤维素酶预处理、稀盐酸浸提、超声波辅助提取、氯仿萃取一系列方法提取而成。目前，有文献报道荷叶碱能够治疗急性肾损伤[5]、乳腺炎[20]等疾病，但是目前尚未见苍术素和荷叶碱对UC治疗作用的相关报道。

龙脑、葛根素、鱼腥草素钠、山奈酚、芝麻素、王浆酸、广藿香酮、甘草苷是从不同植物中提取的物质，它们都具有抗炎作用，并曾被报道过可以治疗UC。因此，本试验旨在通过探究不同植物成分对DSS诱导的UC模型小鼠的保护作用，找到有望成为临床上治疗犬结肠炎的有效新药。

A.小鼠原代腹腔巨噬细胞中TNF-α的水平；B.小鼠原代腹腔巨噬细胞中IL-10的水平

众所周知，UC的症状是腹泻、血便、体质量减轻和结肠长度缩短。试验发现的DAI评分在暴露于DSS后显著增加，结肠缩短，但这些症状在用苍术素和荷叶碱预处理后得到缓解。通过组织病理学观察，发现DSS组黏膜下层和隐窝不规则，而苍术素和荷叶碱组的结构不规则得到明显改善。炎症细胞因子在疾病的发病机制中起重要作用。炎性细胞因子与结肠炎的发病机制密切相关，一旦肠道屏障受损，肠上皮细胞会释放细胞因子IL-1β和TNF-α，募集大量免疫细胞，引起体内过度炎症。IL-10 是一种由造血细胞产生的抗炎细胞因子，可以评估炎症的严重程度。本试验结果表明，苍术素和荷叶碱治疗组中TNF-α和IL-1β的水平降低，而IL-10的水平升高。同时，苍术素和荷叶碱也可调节LPS刺激的原代腹腔巨噬细胞的炎症水平。我们认为苍术素和荷叶碱对DSS引起的结肠炎有保护作用，可以减轻质量减轻和腹泻，并且缓解组织病变和炎性细胞因子分泌情况。但已被报道过对UC有效的龙脑、山奈酚、芝麻素、广藿香酮、甘草苷组小鼠和葛根素、鱼腥草素钠、王浆酸组并未出现与DSS明显的差异，证明在此种动物模型中，这些植物成分对UC的治疗效果并不是很理想，在今后使用以上几种植物成分治疗UC上需要多加考虑。

综上所述，苍术素和荷叶碱能够显著降低UC的严重程度，具有一定的抗结肠炎效应。但龙脑、葛根素、鱼腥草素钠、山奈酚、芝麻素、王浆酸、广藿香酮和甘草苷对UC的治疗效果并未得到充分体现，也可能与本次试验的药物厂家、药物浓度以及试验模型有关。因此，苍术素和荷叶碱可能是防治UC的新的天然产物，对今后在临床上对人和动物结肠炎的治疗具有重要意义。