猪肺炎支原体融合蛋白MHP-P46-P36的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

李书光，张 娣，赵家磊，杨立芳，李 峰，沈志强,*，李同斌

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州265200；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 265200；3.青岛农业大学，山东 青岛 256600；4.无棣县畜牧兽医服务中心，山东 无棣 251900)

猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是猪呼吸道疾病的主要病原之一[1]，其诱发的疾病称为猪支原体肺炎、猪气喘病，该病发病率高、病死率低，难以治愈，继而造成饲料转化率降低及其他继发性疾病[2]。猪气喘病的感染可以在全世界范围内发生，属于养猪业较为常见的传染病，给养猪业造成重大经济损失[3]。现阶段，有效预防控制猪支原体肺炎的关键措施是疫苗接种，其能够显著减少猪肺炎支原体感染造成的肺脏病变，提高日增重，降低母猪带菌率[4]。

目前，Mhp流行病学调查较为常用的方法为血清学检测方法[5]，由于ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高的特点，成为了最广泛的检测方法[6-7]。鉴于目前的ELISA检测试剂盒较为昂贵，同时在检测抗体时，与预期抗体变化曲线不一致，因此建立一种操作简单、成本低、更加可靠有效的Mhp抗体ELISA检测方法，是研究Mhp流行病学调查和疫苗效力检验过程中迫切需要解决的问题。本试验对免疫原性好、特异性高的早期抗体产生的P46蛋白和中后期抗体产生的P36蛋白进行抗原表位分析和串联融合表达、纯化，并建立了基于融合蛋白MHP-P46-P36的ELISA方法，且进行了初步应用，以期为Mhp的血清学诊断提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒、菌株及主要试剂表达菌株BL21(DE3)为山东省滨州畜牧兽医研究院山东省滨州预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存；猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒阳性血清以及Mhp阴性血清和阳性血清由山东绿都生物科技有限公司技术服务部提供；临床血清来自于滨州某集团生猪养殖场。葡萄球菌A蛋白HRP(PPA)购自武汉博士德生物工程有限公司；TMB显色剂、CBA Protein Assay Kit购自北京康润诚业生物科技有限公司；IDEXX动物疫病检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；酶标His蛋白抗体HRP-66005、增强型DAB显色试剂盒购自Proteintech Group；HIS标签纯化柱购自GE公司，BCA蛋白质量浓度测定试剂盒购自白鲨生物科技。

1.2 蛋白抗原表位的预测及基因合成使用在线分析http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/和https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html 进行B细胞表位联合预测。将2个蛋白的抗原表位富集区使用柔性蛋白linker进行连接，编码融合蛋白基因序列经过密码子优化后，送通用生物(安徽)科技有限公司合成并插入pET-30a表达载体中，命名质粒为pET-46+36。

1.3 融合蛋白MHP-P46-P36的诱导表达及可溶性分析将由通用生物(安徽)科技有限公司构建的pET-46+36重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态，获得BL21(pET-46+36)菌种，用IPTG进行融合蛋白的诱导表达。诱导后的菌液经离心浓缩、洗涤后，超声破碎，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。

1.4 蛋白的纯化及质量浓度测定用0.1 μm孔径的滤膜过滤上述诱导蛋白超声破碎后的上清样品，按照GE商品化HIS标签纯化柱说明进行蛋白的纯化，并用SDS-PAGE电泳进行纯度分析。使用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒进行蛋白质量浓度测定后，-20℃保存备用。

1.5 ELISA检测方法的建立

1.5.1抗原包被质量浓度和最佳血清稀释度的确定 将纯化所得的重组蛋白MHP-P36-P46用碳酸包被液(CBS)分别按照质量浓度160.0，80.0，40.0，20.0，10.0，5.0，2.5 mg/L稀释抗原，100 μL/孔，4℃过夜；阴阳性血清分别按照 1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320进行倍比稀释，阴、阳性血清各设2个重复，按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，测定D450 nm值，并计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.5.2最佳封闭液的确定 分别使用1%BSA、3%BSA、5%BSA、5%鸡血清以及5%脱脂奶粉，300 μL/孔，于37℃温箱中封闭2 h，按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴、阳性血清各做2次重复，测定D450 nm值，并计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.5.3最佳血清作用时间的确定 按照上述筛选出来的条件， 按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，一抗分别于37℃温箱中孵育30，60，90 min，阴、阳性血清各做2次重复，测定D450 nm值，并计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.5.4最佳酶标二抗工作浓度的确定 按照上述筛选出来的条件，按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，将酶标二抗用已确定的最佳封闭液按 1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000， 1∶10 000进行倍比稀释，阴、阳性血清各做2次重复，测定D450 nm值，计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.5.5最佳酶标二抗作用时间的确定 按照上述筛选出来的条件，按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，加入最佳稀释度的酶标二抗，分别于30，60，90 min后结束反应，按阴、阳性血清各做2次重复，测定D450 nm值，计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.5.6最佳显色时间的确定 按照上述筛选出来的条件，以间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，各孔加入底物混匀后，室温避光显色，分别于10，15，20 min后加入2 mol/L H2SO450 μL终止液停止反应，阴、阳性血清各做2次重复，测定D450 nm值，计算阳性D450 nm与阴性D450 nm值的比值(P/N)。

1.6 重复性试验

1.6.2批间重复试验 取不同批次的ELISA酶标板，按照上述已经建立的间接ELISA检测方法对已知的阴阳性猪血清各3份进行检测，每份样品平行设立3次重复，测出D450 nm后，计算变异系数。

1.7 特异性试验分别选择猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒阳性血清，应用建立的间接ELISA检测方法进行交叉检测，每份血清重复检测6 孔，比较其特异性。

1.8 临床样本检测及符合率采用本研究所建立的间接ELISA检测方法对来自山东滨州某集团生猪养殖场的156份待检血清进行检测，并与IDEXX Mhp抗体检测试剂盒的检测结果进行比较。

2 结果

2.1 抗原表位分析及融合蛋白的基因序列分析可知，胞浆蛋白P36无跨膜区和信号肽，B细胞表位富集区集中在氨基酸60～90，205～230，280～300位。膜蛋白P46氨基酸的9～31位为跨膜区，20～40位为预测的信号肽区；B细胞表位富集区集中在氨基酸30～100，140～200，320～405位。P36蛋白选取编码37～168位氨基酸的基因序列，P46蛋白选取编码31～134位氨基酸的基因序列，选择常规的柔性蛋白linker(甘氨酸+丝氨酸)，为了提高其蛋白表达量，进行了相应的密码子优化。该序列由通用生物(安徽)进行基因合成，并插入pET-30a表达载体中，构建融合蛋白表达重组质粒pET-46+36。

2.2 MHP-P46-P36蛋白的表达及鉴定随机挑取3个BL21(pET-46+36)表达菌经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示该重组蛋白约为37 kDa，与预计结果相符(图1)。超声破碎后的菌体上清和沉淀，SDS-PAGE电泳分析显示，该蛋白主要以可溶性形式存在(图2)。

1.BL21(pET-46+36)诱导前;2,3,4.BL21(pET-46+36)1、2、3号菌诱导后;M.蛋白Marker

1.BL21(pET-46+36)诱导前;2.BL21(pET-46+36)诱导后超声上清;3.BL21(pET-46+36)诱导后超声沉淀;M.蛋白Marker

2.3 MHP-P46-P36蛋白的纯化及定量亲和层析法进行纯化后的蛋白，SDS-PAGE电泳分析结果显示，纯化效果较好(图3)。BCA蛋白质量浓度标准曲线见图4，方程为y=1 115.1x-113.02(R2=0.997)，纯化融合蛋白样质量浓度为3 959 mg/L。

1.MHP-P46-P36纯化前;2.MHP-P46-P36蛋白纯化后;M.蛋白Marker

图4 BCA法蛋白质量浓度标准曲线

2.4 最佳反应条件的确定综合试验中阴、阳性数值及其比值，确定最适抗原包被质量浓度为10 mg/L，最佳血清稀释度为 1∶40，质量分数1%BSA为最佳封闭液；一抗最佳反应时间为1 h，二抗的最佳稀释倍数为 1∶4 000，最佳作用时间为1 h；最佳显色时间为15 min。

2.6 重复性试验

2.6.1批内重复试验 取同一批次的ELISA酶标板，按照上述已经建立的间接ELISA检测方法对已知的阴、阳性猪血清各3份进行检测，每份样品平行设立5次重复，根据测出的D450 nm值计算变异系数的结果显示(表1)，阳性血清变异系数小于2%，阴性血清变异系数小于6%，表明同一个样本在同一批次的酶标板内变异系数小，该方法具有良好的重复性。

表1 批内重复试验结果

2.6.2批间重复试验 取3个不同批次的ELISA酶标板，按照上述已经建立的间接ELISA检测方法对已知的阴、阳性猪血清各3份进行检测，根据测出的D450 nm计算变异系数的结果显示(表2)，可知阳性血清变异系数小于3%，阴性血清变异系数小于6%，表明同一个样本在不同批次的酶标板内变异系数小，该方法具有良好的重复性。

表2 批间重复试验结果

2.7 特异性试验应用建立的间接ELISA检测方法检测猪瘟病毒阳性抗体、猪伪狂犬病病毒阳性抗体、猪鼻支原体阳性抗体、猪絮状支原体阳性抗体、猪蓝耳病病毒阳性抗体和猪圆环病毒阳性抗体的血清，数值均小于0.385为阴性，显示该方法具有良好的特异性。

2.8 临床样本检测及符合率试验用上述建立并优化的间接ELISA检测方法对来自滨州某集团生猪养殖场的156份血清进行检测，测出的阳性样品为102份，阴性样品为54份，阳性率65.4%；用IDEXX Mhp抗体检测试剂盒进行检测，测出的阳性样品为123份，阴性样品为33份，阳性率78.8%，两者阳性符合率为83.0%，总符合率为71.2%。(表3)

表3 临床样品的检测结果 份

3 讨论

Mhp主要导致猪地方流行性肺炎的发生，该病是一种慢性呼吸系统疾病，在世界范围内广泛发生，造成饲料转化率降低及其他继发性疾病给养猪业造成重大经济损失[8]。Mhp的全基因长度为580～1 350 kb，碱基中G+C含量约为30%，在大肠杆菌中的TGA终止密码子在支原体内能够编码Trp氨基酸[9]。用大肠杆菌表达目标蛋白时，信号肽是无效蛋白而且其疏水性容易造成目标蛋白的不可溶性和蛋白的非正确折叠[10]。P46蛋白是Mhp具有种特异性的表面膜蛋白，能够在Mhp感染早期诱导机体产生免疫应答，是Mhp的主要优势抗原蛋白[11-12]。P36蛋白也是Mhp的种特异性蛋白，也称之为乳酸脱氢酶，是一种细胞溶质蛋白，它在猪肺炎支原体感染过程中可能起主要作用，故产生抗体的时间比较晚，一直持续到感染后期[13-14]。在试验研究中，抗原表位分析结合信号肽分析，通过密码子优化截短表达了P36和P46蛋白的融合蛋白，并实现了该蛋白的可溶性表达，为下游蛋白纯化工作的进行提供了便利。

祝永琴等[13]开展了Mhp P36蛋白的间接ELISA试验研究，与IDEXX检测试剂盒的符合率在73%左右，能够有效检测疫苗免疫后的抗体变化，同时指出单一的P36蛋白作为包被抗原可能存在假阴性。沈青春等[11]使用重组表达的P46蛋白作为包被抗原，成功建立了Mhp的ELISA检测方法。冯志新等[15]和田瑞雨[16]开展了P46蛋白的单克隆抗体研究，并用于Mhp抗原的定量检测。丁志勇[14]分别表达了P36、P46和P97蛋白，多个蛋白混合后作为包被抗原的抗体检测方法比单蛋白作为包被抗原ELISA抗体检测方法更加准确。姚景霆[17]开展了分泌型IgA抗体的ELISA方法研究工作，认为P36、P46和P97蛋白作为包被检测抗原差异不显著。本试验参照文献[18-19]选取高度保守具有种特异性膜蛋白和胞质蛋白的抗原表位富集区，作为ELISA包被抗原，既保证了该方法的特异性，同时又能够保证全程监测Mhp早期感染和中晚期感染的抗体变化水平。