UPLC-MS/MS测定燕窝中18种氨基酸

白伟娟，张小江，柳训才，张晓婷，范群艳，林素琼

厦门市燕之屋丝浓食品有限公司（厦门 361100）

燕窝是由金丝燕属（Aerodramus）和侏金丝燕属（Collocalia）金丝燕的唾液与其绒羽筑成的巢穴的天然食品[1]，燕窝大多产于泰国、印度尼西亚和马来西亚等东南亚一带，因其产量少、味道鲜美，具有“东方鱼子酱”之称，是被受欢迎药食同源的高级保健食品。据文献记载，关于燕窝疗效最早见于清代王昂所著作《本草备要》，关于疗效详细记载主要是赵学敏在《本草纲目拾遗》书中记载：“燕窝，味甘淡平，大养肺阴，化痰止咳，补而能清，为调理虚损劳积之圣药[2]”。现代研究结果表明燕窝具有抗流感病毒和抑制性血凝[3-4]、提高智力和记忆力[5-6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]等功能。因此，燕窝在中国长期以来备受追捧。

燕窝作为一种药食同源的高端滋补品，深受消费者的喜爱，但因其产量小、供不应求、工序繁琐等原因，导致燕窝价格高。为牟取更多利益，不良商家在燕窝中掺假造假、以次充好，使燕窝质量参差不齐，给市场和消费者造成困扰。由于氨基酸是组成蛋白的基本单位，对氨基酸检测方法有荧光光谱法[9]、分光光度发[10-11]、毛细电泳法[12]、近红外光谱法[13-14]、化学发光法[15]、高效液相色谱法[16-19]、气相色谱与质谱联用法[20]、液相色谱与质谱联用法[21-22]、氨基酸自动分析仪[23-24]等。燕窝中氨基酸检测多数采用氨基酸自动分析仪[25-28]。液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）具有灵敏度高、选择性强及同时检测多组分等优点，但其易受样品基质影响。试验主要利用超高效液相色谱-串联质谱建立燕窝中18种氨基酸检测方法，旨在为燕窝质量标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

燕窝（厦门市燕之屋丝浓食品有限公司）。

甲酸、甲醇（色谱纯，美国天地）；17种氨基酸标准品（天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸，北京世纪奥科生物技术有限公司）；色氨酸标准品（美国Sigma）；盐酸、氢氧化钠（优级纯，国药集团）；苯酚（分析纯，西陇科学）。

超高效液相色谱-串联质谱联用仪（LCMS 8050，岛津）；冻干机（Alpha 2-4 LSC plus，德国Christ）；电子天平（BSA224S，Sartorius）；全自动氮吹浓缩仪（Auto EVA-20Plus，睿科）；恒温箱（DIN 12880，德国宾得）。

1.2 样品前处理

1.2.1 17种氨基酸样品前处理

称取20～40 mg（精确至0.000 1 g）粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中，在安瓿瓶中加入5 mL 6 mol/L盐酸溶液，继续向安瓿瓶中加入1滴0.1%苯酚混匀，将安瓿瓶放入全自动氮吹浓缩仪中，充入氮气5 min，在充氮气状态下封口。将已封口的安瓿瓶放在110 ℃的恒温箱内，水解22 h后，取出，冷却至室温。打开安瓿瓶，将水解液转移至100 mL容量瓶中，用少量水多次冲洗安瓿瓶，水洗液移入同一容量瓶中，用水定容至刻度，振荡混匀，静置。准确移取1.00 mL稀释液移入试管中，置于-40 ℃冷冻冰箱中预冻4 h，将结冰的稀释液放入冻干燥机中进行干燥。待干燥完成，用水进行溶解，定容至25 mL容量瓶，在10 000 r/min下离心10 min，上清液于进样瓶中以备进样，检测甲硫氨酸，再进行稀释10倍，同上稀释液离心，检测其他16种氨基酸。

1.2.2 色氨酸样品前处理

称取20～40 mg（精确至0.000 1 g）粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中，在安瓿瓶中加入4 mL 5 mol/L氢氧化钠溶液。继续向安瓿瓶中加入1滴0.1%苯酚混匀，然后将安瓿瓶放入全自动氮吹浓缩仪中，充入氮气5 min，在充氮气状态下封口。将已封口的安瓿瓶放在110 ℃的恒温箱内，水解22 h后，取出，冷却至室温。打开安瓿瓶，将水解液转移至100 mL容量瓶中，用少量水多次冲洗安瓿瓶，水洗液移入同一容量瓶中，用水定容至刻度，振荡混匀，静置。准确移取1.00 mL稀释液用水定容至25 mL并用甲酸调pH至中性，用0.22 μm滤膜过滤后，过滤液于进样瓶中以备进样，检测色氨酸。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱为岛津C18-AQ，2.1 mm×100 mm，1.9 μm；流速300 μL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；分析时间16 min；流动相A为0.05%甲酸溶液，流动相B为甲醇；洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子化电离源ESI。监测方式：正离子多反应监测（MRM）。接口电压2.5 kV；雾化气流量3 L/min；加热气流量10 L/min；接口温度300 ℃；DL温度250 ℃；加热块温度400 ℃；干燥气流量10 L/min；CID气270 kPa。

1.4 标准工作溶液的配制

1.4.1 17种氨基酸标准工作溶液的配制

准确移取0，0.125，0.250，0.500，1.000，1.500，2.000，2.500和3.000 mL 17种氨基酸混合标准工作液至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配成浓度范围分别为赖氨酸5.00～120 mg/L、胱氨酸5.16～123 mg/L、天冬氨酸10.0～240 mg/L、甘氨酸10.0～240 mg/mL、组氨酸4.00～96.4 mg/L、精氨酸11.0～263 mg/L、丙氨酸7.95～190 g/mL、丝氨酸8.17～196 mg/L、苏氨酸6.64～159 mg/L、谷氨酸7.82～187 mg/L、脯氨酸5.44～ 130 mg/L、缬氨酸6.35～152 mg/L、甲硫氨酸4.41～105 mg/L、亮氨酸5.26～126 mg/L、异亮氨酸5.82～139 mg/L、酪氨酸6.09～146 mg/L、苯丙氨酸6.85～164 mg/L的氨基酸标准曲线工作液。

1.4.2 色氨酸标准工作溶液的配制

准确移取0，0.100，0.200，0.500，1.00，1.50和2.00 mL色氨酸标准工作液至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配成质量浓度范围为10.00～200 ng/mL的色氨酸标准曲线工作液。

2 结果与分析

2.1 线性范围及相关系数

标曲配制见1.4小节。利用氨基酸的峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程，以苯丙氨酸为例，线性回归方程见图1，其线性相关系数大于0.999，其余结果见表3。由表3可见，所有18种氨基酸均呈现良好的线性关系。采用标准溶液逐级稀释的方法确定仪器的检出限（SLOD）和定量限（SLOQ），分别以信噪比rSN≥3和rSN≥10时对应目标物浓度作为仪器检出限和定量限，具体结果见表3。

图1 苯丙氨酸浓度与峰面积曲线图

2.2 方法的精密度

因为燕窝中氨基酸含量高，所以采用不同的取样量考察其准确度，以梯度取样量20，30和40 mg分别进行6平行精密度试验，计算精密度，SRSD在0.85%～ 4.98%之间，具体结果见表4。

表4 18种氨基酸的精密度（n=6）

接表4

2.3 燕窝中氨基酸的分析研究

图3 燕窝中17种的分离色谱图

对燕窝样品进行酸水解和碱性水解，通过LCMS/MS对天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和胱氨酸17种氨基酸和色氨酸进行检测（见图2～图4）。

图2 18种氨基酸混标的分离色谱图

图4 燕窝中色氨酸的分离色谱图

利用LC-MS/MS对盐酸水解和碱性水解的30批燕窝样品进行分析比较，并对其获得结果进行整理。由表5和表6可以看出，30批燕窝均含有18种氨基酸，其中包含8种必需氨基酸。计算出18种氨基酸总含量、必需氨基酸占总氨基酸的比值、各种氨基酸含量占总氨基酸的比值及比值范围。结果表明：燕窝的总氨基酸含量在59.10～68.73 g/100 g之间；必需氨基酸含量在20.91～25.57 g/100 g之间，必需氨基酸占总氨基酸比例35.3%～39.60%；在氨基酸组成中，胱氨酸含量最高，占总量的10%～14%，甲硫氨酸含量最低，占总量0.5%～0.7%，其他氨基酸的含量均在2%～9%之间。30批燕窝18种氨基酸含量相对标准偏差在3.77%～ 14.83%之间，说明各个批次间燕窝中氨基酸成分组成均存在较大变异[26]。

3 结论

30批燕窝中总氨基酸含量在59.10～68.73 g/100 g之间，必需氨基酸含量在20.91～25.57 g/100 g之间，必需氨基酸占总氨基酸比例35.3%～39.60%。各个批次燕窝中氨基酸含量存在一定程度的差异，主要原因可能是燕窝中水分差异、金丝燕品种、成熟度、生活环境等。30批燕窝中氨基酸组成比例相近，均检出18种氨基酸（天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），燕窝中氨基酸含量丰富，且氨基酸对人体的新陈代谢具有一定作用。