肠杆菌植酸酶基因的克隆及重组表达

程琪，赵东莹，李杨，包永明,

（1.大连理工大学海洋科学与技术学院，辽宁 盘锦 124221；2.大连理工大学生物工程学院，辽宁 大连 116024）

植酸酶，又称肌醇六磷酸水解酶，可水解植酸，产物为磷酸及肌醇衍生物[1]。植酸酶添加到饲料中，不仅可以提高动物对饲料中磷和其他元素的利用率，还可以减少动物粪便中磷含量，降低对土壤环境的污染[2-3]。根据最适pH值可将植酸酶分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶；根据立体专一性可分为3-植酸酶、5-植酸酶和6-植酸酶；根据催化机理和结构可分为组氨酸酸性植酸酶（HAPhy）、β—螺旋桨植酸酶（BPP）、半胱氨酸磷酸酶植酸酶（CPhy）和紫色酸性磷酸酶植酸酶（PAPhy）。植酸酶在自然界中广泛存在于植物、动物和微生物中，其中由于动植物体内植酸酶产量和酶活性相对较低[4]，相关研究也较少。目前工业化生产的植酸酶多来自于真菌，其中曲霉菌属的黑曲霉应用较多，其植酸酶活性虽较高，但pH值适用条件较苛刻，限制其在动物饲料和酶制剂领域的应用[5]。20世纪80年代陆续筛选出产植酸酶的细菌，且产生的植酸酶往往有一些特性，如枯草芽孢杆菌植酸酶的活性与稳定性需要与Ca2+联用才能体现等[6]。由于细菌植酸酶具有较高的热稳定性及蛋白酶水解稳定性，有良好的开发空间[4]。然而，由于细菌植酸酶表达量较低限制其规模化生产与应用，因此克隆细菌植酸酶基因，构建高效表达的工程菌进行异源表达可获得高产量的酶，酶学特性也因其易分离纯化而得到更好的解析。

前期从土壤中筛选出一株可以水解有机磷的菌株，经鉴定为阿氏肠杆菌，命名为Enterobacter asburiaeZSH Y1。本研究利用PCR技术，从其基因组克隆植酸酶基因phyE，构建重组表达载体，在大肠杆菌中实现异源表达植酸酶；分析植酸酶PhyZSHY1-nsp与报道植酸酶的同源性，分离纯化重组植酸酶PhyZSHY1-nsp，研究其酶学性特性，为工业酶制剂的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：本研究中所使用的产植酸酶菌株为前期实验室筛选获得，经过生理生化及分子生物学鉴定确定为Enterobacter asburiaeZSH Y1[7]。重组表达使用菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)为本实验室保藏。

质粒：pET28a(+)为本实验室保存。

培养基：（1）蒙金娜培养基。10.0g·L-1葡萄糖，0.3g·L-1KCl，0.3g·L-1NaCl，0.5g·L-1(NH4)2SO4，0.03g·L-1Mn-SO4·4H2O，0.3g·L-1MgSO4·7H2O，0.03g·L-1FeSO4·7H2O，2.0g·L-1植酸钠，pH值7.0，115℃灭菌20min。（2）LB液体培养基。10.0g·L-1蛋白胨，10.0g·L-1NaCl，5.0g·L-1酵母浸粉，pH值7.5，121℃灭菌20min。固体培养基在其基础上添加20.0g·L-1琼脂粉。

硫酸卡那霉素：配置母液浓度50mg·mL-1，使用终浓度为50μg·mL-1，置于-20℃保存。

IPTG：配置母液浓度为1mol·L-1使用终浓度为1mM，置于-20℃保存。

Tris-HCl缓冲液母液：1mol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

细胞破碎液：50mmol·L-1MTris-HCl，50mmol·L-1NaCl，pH值7.4。

Ni-NTA纯化平衡缓冲液（Binding Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

Ni-NTA纯化清洗缓冲液（Wash Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，0.5mol·L-1NaCl，25mmol·L-1咪唑，pH值7.4。

Ni-NTA纯化洗脱缓冲液（Elution Buffer）：20mmol·L-1Tris-HCl，0.5mol·L-1NaCl，0.5mol·L-1咪唑，pH值7.4。

透析缓冲液：50mmol·L-1Tris-HCl，40%蔗糖，pH值7.4。

Q柱纯化缓冲液（A液）：20mmol·L-1Tris-HCl，pH值7.4。

Q柱纯化缓冲液（B液）：20mmol·L-1Tris-HCl，1mol·L-1NaCl，pH值7.4。

以上缓冲液均过膜后，121℃灭菌20min，室温保存。

仪器：酶标仪SpectraMax M2e（美国Molecular Devices）、全温振荡培养箱ZQPL-200（天津莱玻特瑞仪器设备有限公司）、高压蒸汽灭菌锅SS-325（日本TOMY）、超声破碎仪UP 200H(德国Dr.Hielscher)等。

试剂、酶和试剂盒：植酸钠购于Sigma公司；蛋白质标准分子量Marker、BSA标准品购于Solarbio公司；DL10000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase（2×）购于Takara公司；限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ、Quick Ligation™快速连接试剂盒购于New England Biolabs公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购于上海生工公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京天根公司；其余试剂购于天津大茂。

1.2 方法

1.2.1 基因组提取采用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取E.asburiaeZSH Y1的全基因组，具体操作步骤与细节参照试剂盒说明书。

1.2.2 菌株E.asburiaeZSH Y1植酸酶基因克隆基于已报道的肠杆菌植酸酶基因进行多重序列比对，选取高度保守的N端与C端区域，设计上下游引物并组合成4对引物（表1）进行PCR扩增。PCR扩增体系为上下游引物各1μL，模板DNA1μL，高保真酶Prime STAR Max DNA Polymerase（2×）25μL，ddH2O22μL。扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s(1kb·min-1),30个循环，72℃延伸7min。

表1 E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆引物Table 1 Cloning primer for E.asburiae ZSH Y1 phytase gene

通过NCBI比对分析克隆得到的肠杆菌植酸酶部分基因序列，显示其与数据库中提交的肠杆菌全基因组序列具有较高的相似性，选择、设计用于扩增植酸酶全长基因序列的引物（表2），以E.asburiaeZSH Y1基因组为模板，PCR扩增E.asburiaeZSH Y1的植酸酶全长基因，PCR扩增体系和程序同上，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收扩增片段，送上海生工测序；测序得到的序列分别进行开放框阅读分析，确定植酸酶编码基因phyE。

表2 植酸酶全基因phyE扩增引物Table 2 Primers for phyE amplificarion

1.2.3 重组表达质粒的构建根据测序获得E.asburiaeZSH Y1植酸酶全长无信号肽基因序列phyE-nsp，设计带有限制性酶NdeⅠ、XhoⅠ位点的引物Fnsp和Rnsp（表3）进行PCR扩增，双酶切phyE-nsp PCR片段和pET28a(+)质粒，T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒。

表3 无信号肽基因phyE-nsp带酶切位点扩增引物Table 3 Primers with restriction site for no signal peptide gene phyE-nsp

1.2.4 重组质粒的转化采用热激法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB的抗性平皿，培养箱37℃倒置培养12～16h。挑取平板上单一菌落至5mL的抗性LB液体培养基，培养12h。

1.2.5 重组质粒的验证提取单一菌落的质粒，双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测，确认酶切片段与连接前片段大小一致后，重组质粒送至测序公司测序。

1.2.6 重组植酸酶的表达测序正确的重组质粒pET28a(+)-phyE-nsp转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布平皿37℃培养12h，挑取菌落接种于抗性LB液体培养基中，摇床37℃，180r·min-1培养3h，加入IPTG至终浓度为1mmol·L-1，于16℃摇床中180r·min-1培养16h。

1.2.7 重组植酸酶的纯化培养菌液于4℃冷冻离心机中，10000g离心10min，收集菌体，细胞悬浮洗涤两次后，加入适量细胞破碎液和溶菌酶，室温放置15min后超声破碎，破碎液12000g离心10min，收集上清液，0.22μm无菌滤膜过滤后，获得样品。（1）Ni柱亲和层析分离，使用5倍柱体积（CV）的纯水冲洗Ni柱，再用5CV的Binding buffer平衡Ni柱后，样品上样后，用2CV的Wash buffer洗脱未结合的杂蛋白，用2CV的Elution buffer洗脱Ni柱，收集洗脱液，收集样品经浓缩透析脱盐后，测定酶活与蛋白浓度。（2）阴离子交换（Q FF离子）分离，采用Purifier 10（GE Healthcare）使用5CV的纯水冲洗Q柱，再用A液平衡层析柱，Ni柱纯化样品上样，用A液平衡后，采用0～1mol·L-1NaCl梯度洗脱，在线监测OD280值，收集分离组份，样品测定酶活与蛋白浓度后，12.5%SDS-PAGE电泳检测。

1.2.8 植酸酶活力检测按照国标《饲用植酸酶活性的测定—分光光度法》（GB/T 18634—2009）测定样品植酸酶活性。酶活单位定义为：在37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从浓度5.0mmol·L-1植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位（U）。

1.2.9 重组植酸酶酶学性质表征（1）最适温度和温度稳定性。在pH值5.5条件下，分别在20～70℃的温度范围内测定纯酶酶活，确定酶的最适温度。将纯化的植酸酶分别在20～60℃孵育180min后，于37℃测定酶活，分析植酸酶的热稳定性。（2）最适pH值和pH稳定性。在37℃条件下，分别在pH值2.0～10.0测定酶活，确定酶的最适pH值。将纯化的植酸酶分别与pH值2.0～10.0的缓冲液孵育1h后测定酶活，分析植酸酶的pH稳定性。所用缓冲液为：pH值2.0～3.5，0.1mol·L-1甘氨酸—HCl缓冲液；pH值4.0～6.0，0.1mol·L-1乙酸—乙酸钠缓冲液；pH值6.5，0.1mol·L-1柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液；pH值7.0～9.5，0.1mol·L-1Tris—HCl缓冲液；pH值10.0，0.1mol·L-1甘氨酸—NaOH缓冲液。（3）金属离子和潜在抑制剂。在最适温度和pH的条件下，分别将纯化的植酸酶与终浓度1mmol·L-1和5mmol·L-1的金属离子和潜在抑制剂孵育1h后，测定酶活。（4）酶反应动力学。在37℃、pH值5.5的条件下，分别以不同浓度（0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，8，10mmol·L-1）的植酸钠为底物，测定植酸酶活力，通过Lineweaer-burk双倒数曲线获得动力学参数Km和kcat。

1.3 数据统计与分析

所有试验均设置3组平行，数据由平均值±标准偏差组成，利用Origin 2017制图。采用SPSS 26软件中的ANOVA的单因素方差进行统计分析，p＜0.05时表示存在显著差异；p＜0.01时，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆

利用肠杆菌来源植酸酶的N-端和C-端保守区域设计引物的4对引物，以E.asburiaeZSH Y1基因组为模板进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。引物F1R1与F2R1扩增出与保守序列大小一致的片段，结合菌株在蒙金娜固体培养基平板上出现溶磷圈，证明菌株E.asburiaeZSH Y1有植酸酶的基因，可以表达植酸酶。

图1 E.asburiae ZSH Y1植酸酶基因克隆Figure 1 Cloning of E.asburiae ZSH Y1 phytase gene

引物TF1TF2、TR1TR2以E.asburiaeZSH Y1的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图2。将片段分别纯化回收并测序，对扩增产物1-X（2399bp）、1-S（1735bp）和A1427（1427bp）这3个序列进行开放阅读框分析（Open Reading Flame），在NCBI数据库BlastX分析后，确定了全长植酸酶PhyZSHY1的全基因序列phyE（1359bp）与氨基酸序列(452aa)，得到菌株E.asburiaeZSH Y1的理论全长植酸酶基因（图3）。

利用在线软件SignalP 5.0对植酸酶PhyZSHY1的氨基酸序列进行分析，确定了其在N-端包含一个长度为20aa的信号肽序列，信号肽的切割位点在氨基酸A20和A21之间。将去除信号肽的PhyZSHY1-nsp氨基酸序列进行InterPro保守域结构分析后，确定序列含有1个植酸酶家族保守域序列PF13449（P53—F391），表明其具有磷酸二酯酶的活性，属于植酸酶超家族cl26171的一员。在UniProt中比对植酸酶（登录号：Q328Q5）与PhyZSHY1-nsp同源性达88%；基于氨基酸序列多重比对(图4)，构建系统发育树(图5)，植酸酶PhyZSHY1-nsp与E.hormaechei来源的植酸酶（登录号：WP_157970380）具有100%的同源性，但未见植酸酶（登录号：WP_157970380）的酶学性质、结构与功能报道。

选取植酸酶（登录号：Q328Q5）为模板在SWISSMODEL中对植酸酶PhyZSHY1-nsp进行同源建模（图6），它的结构包括31个β折叠，9个310螺旋和1个α螺旋，判断为α+β类蛋白质。

图2 引物TF1、TR1扩增结果（1-X、1-S）与引物TF2、TR2扩增结果（A1427）Figure 2 DNA 1-X and 1-S from primer TF1TR1 and A1427 from TF2，TR2

图3 ORF分析全长植酸酶PhyZSHY1的全基因序列phyE与氨基酸序列Figure 3 phyE and amino acid sequence of PhyZSHY1 by ORF

2.2 重组菌株构建及诱导表达

2.2.1 PhyZSHY1重组菌株构建重组质粒pET28a(+)-phyE-nsp采用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳如图7，酶切产物的两条片段，长度分别与目的基因phyE-nsp和pET28a(+)一致，测序结果证明目的基因正确。

2.2.2 重组质粒pET28a(+)-phyE-nsp诱导表达及纯化重组菌株pET28a(+)-phyE-nsp/BL21(DE3)经低温诱导16h后，离心收集菌体，破碎菌体、离心收集上清液，HisTrap分离纯化后，收集活性组分，进行第二步Q Sepharose Fast Flow分离纯化，洗脱曲线如图8，活性峰为0.1mol·L-1NaCl的洗脱峰。经SDS-PAGE分析，获得纯化的重组植酸酶PhyZSHY1-nsp（图9）。

图4 植酸酶PhyZSHY1多重序列比对Figure 4 Alignment of amino acid sequences for PhyZSHY1

图5 植酸酶PhyZSHY1-nsp的氨基酸序列系统发育树Figure 5 Phylogenetic tree base on amino sequences of PhyZSHY1-nsp

图6 植酸酶PhyZSHY1-nsp同源建模三级结构Figure 6 Homology modeling structure of Phytase phyZSHY1-nsp

2.2.3 植酸酶PhyZSHY1-nsp精确分子量测定 通过在线软件ExPASy对重组植酸酶PhyZSHY1-nsp分析，得到其理论分子量和等电点分别为48817.21Da和5.72。将获得的纯化样品进行四极杆-静电场轨道阱高分辨液相色谱质谱联用分析，得到其实际分子量为48817.87Da（图10），与预测结果一致，证明获得纯化的植酸酶。

2.3 重组植酸酶PhyZSHY1-nsp的酶学性质分析

2.3.1 最适温度与温度稳定性以5℃的梯度考察温度对PhyZSHY1-nsp活性的影响，PhyZSHY1-nsp的最适作用温度为60℃（图11）。

图7 重组质粒pET28a(+)-phyE-nsp酶切验证Figure 7 Identification of recombinant plasmid pET28a(+)-phyE-nsp by enzyme digestion

图8 重组植酸酶PhyZSHY1-nsp离子交换层析洗脱曲线Figure 8 Ion exchange chromatography elution curve of PhyZSHY1-nsp

图9 纯化重组植酸酶PhyZSHY1-nsp的SDS-PAGE电泳图Figure 9 SDS-PAGE analysis of the purified PhyZSHY1-nsp

植酸酶PhyZSHY1-nsp的温度稳定性如图12，在低于40℃的温度下较稳定，其活性保持在60%以上，50℃孵育后，植酸酶活性维持在最大活性的50%以上，60℃孵育30min后失活，证明植酸酶PhyZSHY1-nsp为中温植酸酶。

2.3.2 pH值对重组植酸酶PhyZSHY1-nsp活性的影响植酸酶PhyZSHY1-nsp的最适pH值为4.5。当pH值小于4.0或大于7.0时，活性显著降低（图13）。当PhyZSHY1-nsp在pH值4.0～5.5范围内的缓冲液中孵育1h后，酶的相对活力均保持在90%以上，在酸性缓冲液中酶活力明显高于碱性缓冲液中，并且活力相对稳定（图14），说明PhyZSHY1-nsp是酸性植酸酶。

2.3.3 金属离子和抑制剂对植酸酶PhyZSHY1-nsp活性的影响PhyZSHY1-nsp与1mmol·L-1和5mmol·L-1的金属离子和潜在抑制剂分别孵育后（表4），Cu2+、Co2+对植酸酶有抑制作用，其中Cu2+浓度越高抑制作用越强。Na+、Ca2+、K+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+对植酸酶有促进作用，其中Na+、Ca2+在浓度为5mmol·L-1时激活作用强于1mmol·L-1；而K+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+在浓度5mmol·L-1时激活作用弱降低；EDTA对植酸酶活性影响不大；SDS会明显抑制活性。

图10 植酸酶PhyZSHY1-nsp的精确分子量Figure 10 Accurate molecular weight of PhyZSHY1-nsp

图11 植酸酶PhyZSHY1-nsp的最适温度Figure 11 Optimal temperature of PhyZSHY1-nsp

图12 植酸酶PhyZSHY1-nsp的温度稳定性Figure 12 Thermostability of PhyZSHY1-nsp

图13 植酸酶PhyZSHY1-nsp的最适反应pHFigure 13 Optimal pH of PhyZSHY1-nsp

图14 植酸酶PhyZSHY1-nsp的pH稳定性Figure 14 pH stability of PhyZSHY1-nsp

2.3.4 植酸酶PhyZSHY1-nsp的动力学性质在37℃，pH值5.5的条件下，利用不同浓度的植酸钠为底物测定植酸酶的反应初速率，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法作图，经线性回归计算反应动力学参数（图15）：植酸酶对植酸钠的水解作用符合米氏方程，求得植酸酶的米氏常数Km为0.86mmol·L-1，最大反应速率Vmax为0.62μmol·min-1mgprotein-1，kcat为16.04s-1，kcat/Km为18.66L·s-1·mmol-1。

表4 金属离子与潜在抑制剂对PhyZSHY1-nsp活性的影响Table 4 Effect of metal ions and potential inhibitor on activity of PhyZSHY1-nsp

3 讨论与结论

目前，来源于微生物的植酸酶多数是组氨酸酸性磷酸酶植酸酶（HAPhy），其空间构象中，活性部位的一些保守氨基酸形成一个可以与底物结合的口袋，活性部位通常包括两个功能部位，一是位于N端的“RHGXPXP”元件的“结合部位”，另一个是位于C端的“HD”元件的“催化部位”[8]。杆菌植酸酶通常不存在保守元件“RHGXPXP”，其活性和稳定性由Ca2+保持[9]，来自B.amyloliquef aciens植酸酶的活性部位有4个Ca2+，且还有两个不同作用的磷酸位点（Pho1和Pho2）[10]。解析植酸酶PhyZSHY1-nsp的氨基酸序列，未发现HAPhy植酸酶常规的活性部位。根据同源建模得到的三维结构分析，PhyZSHY1-nsp活性中心为His17，活性中心位于N端一个β折叠邻近的loop环区[11]。

图15 植酸酶PhyZSHY1-nsp LineWeaver-Burk图Figure 15 Lineweaver-Burk graph of PhyZSHY1-nsp

由于植酸分子的特殊立体构象，植酸酶水解又具有立体专一性，国际纯粹与应用化学联合会-国际生物化学与分子生物学联合会（IUPAC-IUBMB）目前认可3类植酸酶：3-植酸酶、6-植酸酶和5-植酸酶。3-植酸酶首先释放C3位的磷酸基团开始水解植酸，随后释放其他位置的磷酸基团，绝大多数微生物可产3-植酸酶[12]，如Aspergillus niger[13]和Klebsiellasp.ASR1[14]菌株产3-植酸酶，且水解植酸终产物为2-磷酸肌醇单酯。通过在UniProt数据库中与肠杆菌科Shigella dysenteriae植酸酶[15]（登录号：Q328Q5）保守性比对达88%，发育树分析也处于同一分支，植酸酶Q328Q5属于3-植酸酶，因此植酸酶PhyZSHY1-nsp可能属于3-植酸酶，后续需进行试验，根据其水解产物判定植酸酶PhyZSHY1-nsp的分类。

细菌植酸酶因其产量低限制其在工业生产中的应用，分离新的植酸酶基因，构建筛选高产量的重组菌株仍是目前植酸酶研究领域的重点[16-20]。利用大肠杆菌作为宿主菌株异源表达植酸酶已有报道，如GULATI等[21]优化培养基后使得芽孢杆菌植酸酶活性可达到2.9573U·mL-1，芽孢杆菌MD2植酸酶通过生物反应器高效表达，酶活性达327U·mL-1[22]。植酸酶PhyZSHY1-nsp的酶活为1.74U·mL-1，后续可通过蛋白质工程技术如理化设计等提高酶活性。

本研究中，以E.coliBL21(DE3)菌株作为宿主菌株获得的植酸酶PhyZSHY1-nsp为可溶性表达的。经过Ni-NTA和Q FF纯化后，获得了电泳纯的植酸酶，经四极杆-静电场轨道阱高分辨液相色谱质谱联用分析后，分子量为48817.87Da，与报道的大多数细菌植酸酶（37～55kDa）一致[23-25]。

植酸酶PhyZSHY1-nsp的最适反应温度为60℃，高于来源于Bacillus subtilis US417植酸酶最适温度为55℃[26]；而Pedobacter nyackensis植酸酶最适温度仅为45℃[27]。在中低温的环境中，PhyZSHY1-nsp酶活性，即使在50℃孵育3h后，仍能保持50%的活性，可以认为是中温植酸酶。

在酸性环境（pH值4.0～7.0）中，PhyZSHY1-nsp可以发挥60%以上酶活，但在碱性环境中活性骤减，稳定性也不如酸性条件下。多数细菌植酸酶最适pH为酸性，如植酸酶E.coliappA-Q258N/Q349N的最适pH值为4.5[28]，PhyZSHY1-nsp的最适pH值为4.5，属于酸性植酸酶。

通过测定不同金属离子对PhyZSHY1-nsp的影响，发现螯合剂EDTA对酶的活性（5mmol·L-1）没有显著影响，表明该酶不是金属酶[29]。变性剂SDS抑制PhyZSHY1-nsp活性，与文献报道一致[29]。一般来说，除了芽孢杆菌植酸酶活性依靠Ca2+，如B.subtilis植酸酶PhyC必须依靠Ca2+才能发挥催化活性[30-31]；植酸酶活性不需要金属离子[29]，这类植酸酶属于β-螺旋桨植酸酶（BPP），通常是碱性植酸酶[12]。二价金属离子Fe2+和Cu2+对PhyZSHY1-nsp的抑制作用与报道的其他植酸酶一致[24;32]。

植酸酶的开发利用中，将植酸酶制成酶制剂添加进动物饲料中仍是主流，在制粒过程中，高温加热会损害植酸酶的一定活性，因此开发耐热植酸酶依旧是研究的重点。进一步的研究中，可以考虑对重组植酸酶PhyZSHY1-nsp进行定向进化，对其序列中的氨基酸进行定点突变，提高酶的高温稳定性。

本研究基于肠杆菌E.asburiaeZSH Y1降解植酸的特性，筛选、设计引物通过PCR技术克隆植酸酶基因，构建pET28a(+)重组表达质粒，在E.coliBL21(DE3)中实现异源表达。重组植酸酶PhyZSHY1-nsp，采用Ni-NTA和Q-Sepharose Fast Flow进行柱层析纯化；酶学分析表明植酸酶PhyZSHY1-nsp属于3-植酸酶，包含432个氨基酸，重组植酸酶的分子量为48817.21Da，等电点为5.72；酶催化反应的最适温度60℃，最适pH值为4.5，Mg2+、Cu2+、Zn2+、Al3+等金属离子及SDS对酶促反应有抑制作用；底物为植酸钠时，植酸酶Km为0.86mmol·L-1，kcat为16.04s-1，kcat/Km为18.66L·s-1·mmol-1。