中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及自噬相关蛋白评估老年脓毒症患者预后的价值

姜美妮, 梁继芳, 王秀哲, 赵彩霞, 武卫东

(山西白求恩医院重症医学科, 山西 太原, 030032)

脓毒症是一类常见的全身炎症反应综合征，其主要病理过程为在感染、创伤等因素刺激下，患者体内炎性因子及趋化因子大量表达，导致机体处于过度免疫反应状态，在清除病原体过程中对自身组织、器官也产生了一定的损伤[1-2]。脓毒症患者的主要临床特点为低血压、低血氧、代谢性酸中毒和多器官功能衰竭。流行病学资料[3-4]显示，每年约有1 800万新发脓毒症患者，好发于老年人，且发病率呈逐年上升趋势，脓毒症患者死亡率高达30%～70%, 是重症监护室患者死亡的主要病因之一。目前，微生物培养是脓毒症诊治的金标准，但该方式存在耗时较长、准确率不高等缺点[5]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是一类分泌型糖蛋白，既往研究[6]将NGAL作为诊断急性肾损伤的生物标志物。研究[7]证实，在急性肾损伤合并脓毒症患者中, NGAL呈异常表达。自噬是真核生物存在的一种自稳机制，研究[8]表明免疫反应可调节自噬，而自噬也对免疫反应产生一定的影响。近年来研究[9]发现，脓毒症患者的器官损伤与自噬存在一定联系，自噬相关蛋白可导致细胞自噬障碍，进而加速细胞的凋亡和坏死，促进脓毒症的发展。本研究探讨NGAL及自噬相关蛋白Beclin、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)对老年脓毒症患者预后评估的价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2021年1月本院收治的97例老年脓毒症患者为脓毒症组，另选取同期97例体检健康人群为对照组。脓毒症组纳入标准: ① 符合《脓毒症与感染性休克的国际共识(第3版)》[10]相关诊断标准者; ② 重症监护室住院时间≥48 h者; ③ 入院时急性生理与慢性健康(APACHE II)评分>12分者; ④ 临床资料完整者; ⑤ 年龄≥60周岁者; ⑥ 患者及其家属知情且同意。对照组纳入标准: ① 年龄≥60周岁者; ② 近3个月内体检健康者; ③ 研究对象及其家属知情且同意。排除标准: ① 入院时接受抗感染治疗的脓毒症患者; ② 合并免疫缺陷疾病者; ③ 合并其他感染性疾病者; ④ 依从性差者。脓毒症组中男56例，女41例，年龄(69.30±4.30)岁; 原发疾病为外伤52例，手术27例，其他18例; APACHE Ⅱ评分为(17.49±2.24)分，序贯器官衰竭评估量表(SOFA)评分为(6.87±1.35)分。对照组中男52例，女45例，年龄(69.80±5.10)岁。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

所有研究对象在入组时抽取静脉血2管，每管5 mL(脓毒症组在未接受治疗前抽取)，其中一管以3 500转/min离心10 min, 离心半径8 cm, 分离血清，采用免疫比浊法(AU400全自动生化分析仪, Olympus公司，日本)检测C反应蛋白(CRP)水平，采用酶联免疫吸附法(Spectra-MaxParadigm多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司)检测降钙素原(PCT)、NGAL水平，试剂均购自上海碧云天生物科技有限公司; 另一管采用RNA提取试剂盒提取外周全血RNA, 并根据反转录试剂盒进行反转录反应，根据SYBR RT-PCR试剂盒(中国杭州博日科技有限公司)说明书进行RT-PCR实验。反应体系为: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 循环35次。采用2-△△Ct法测定各组BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA相对表达量，内参为GADPH, 每个样本重复3次，取平均值。引物由中国北京鼎国生物科技有限公司合成，序列见表1。

表1 实验引物序列

脓毒症组在入院时评估APACHE Ⅱ评分及SOFA评分，并根据APACHE Ⅱ评分将脓毒症组分为轻度组(n=44)、中度组(n=28)和重度组(n=25)。APACHE Ⅱ评分[11]包括急性生理评分、年龄评分以及慢性健康评分3个方面，分值越高提示患者预后越差。SOFA评分[12]主要内容是对患者以连续形式进行单个器官功能评价，分值越高提示患者预后越差。随访28 d, 根据脓毒症患者存活情况分为存活组(n=71)和死亡组(n=26)。

1.3 观察指标

主要指标: ① 比较脓毒症组与对照组BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平; ②采用Pearson相关法分析脓毒症患者BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平与CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分及SOFA评分的相关性; ③ 比较存活组与死亡组BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平; ④ 采用受试者工作特征(ROC)曲线分析BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平评估患者预后的临床价值。

次要指标: ① 比较脓毒症组与对照组血清CRP、PCT水平; ② 比较脓毒症组轻度、中度、重度患者各项指标水平; ③ 比较存活组与死亡组CRP、PCT水平; ④ 采用ROC曲线分析CRP、PCT评估患者预后的临床价值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计分析，符合正态分布的计量数据采用均值±标准差表示，比较采用独立样本的t检验。计数资料采用[n(%)]表示，比较采用χ2检验。采用Pearson进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脓毒症组与对照组Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL、CRP、PCT水平比较

相较于对照组，脓毒症组NGAL、CRP、PCT水平升高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 脓毒症组与对照组Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL、CRP、PCT水平比较

2.2 不同病情程度脓毒症患者各项指标水平比较

随着脓毒症病情逐渐加重，轻度组、中度组、重度组患者NGAL、CRP、PCT水平逐步越高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平逐步降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 不同病情程度脓毒症患者各项指标水平比较

2.3 脓毒症患者Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平与CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分及SOFA评分的相关性

相关性分析结果显示, CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分及SOFA评分与NGAL水平均呈正相关，与BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平呈负相关(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 脓毒症患者Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平与其他指标的相关性分析

2.4 存活组与死亡组各项指标水平比较

脓毒症患者中，相较于存活组，死亡组NGAL、CRP、PCT水平更高,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平更低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表5。

表5 存活组与死亡组各项指标水平比较

2.5 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平评估患者预后的临床价值

ROC曲线分析结果显示，当CRP截断值为41.81 mg/L时，其评估患者预后的曲线下面积(AUC)为0.62; 当PCT截断值为3.54 ng/mL时，其评估患者预后的AUC为0.73; 当NGAL截断值为153.46 ng/mL时，其评估患者预后的AUC为0.90; 当Beclin mRNA截断值为0.81时，其评估患者预后的AUC为0.89; 当LC3-ⅡmRNA截断值为0.87时，其评估患者预后的AUC为0.87。BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL联合评估患者预后的AUC为0.95。见表6、图1。

图1 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL水平评估患者预后的ROC曲线

表6 CRP、PCT、Beclin mRNA、LC3-Ⅱ mRNA、NGAL水平评估患者预后的临床价值

3 讨 论

脓毒症患者体内会释放大量炎性因子，炎性因子可以促进机体抵御病原体的侵袭，当其过度表达时又会打破免疫反应的平衡，导致免疫功能紊乱。目前，临床上采用部分炎性因子作为评估病情的辅助指标。PCT、CRP是临床上评估炎性反应疾病的常用指标。正常生理条件下, PCT、CRP水平较低，当发生感染时, PCT、CRP水平显著升高。本研究结果显示，相较于正常人群，脓毒症患者PCT、CRP水平均有所升高。既往研究[13]表明, PCT水平升高主要由细菌性感染或细菌释放的内毒素和炎性因子所致，而机体发生病毒性感染或在其他因素刺激下往往并不会引起PCT水平的上升，而脓毒症往往也受病毒感染的影响。此外, CRP水平在自身免疫性疾病、烧伤等情况下也有所上升，具有特异性较差的缺点[14]。因此，将PCT或CRP作为脓毒症的生物标志物往往存在一定的缺点，难以获得较好的效果。本研究发现，相较于存活组，死亡组PCT及CRP水平均有所上升，但CRP及PCT水平评估患者预后的AUC均小于0.8, 且灵敏度及特异度不高，这也进一步说明CRP及PCT作为脓毒症的生物学标志物的不足。

NGAL是一种分泌蛋白，在机体炎性反应、免疫反应、细胞凋亡等过程中起着重要作用。研究[15]表明, NGAL主要在炎性损伤的中性粒细胞或其他细胞中表达; 正常生理条件下，人体外周血NGAL表达极低，当机体处于炎性反应状态时，体内的促炎及抗炎系统会促使中性粒细胞被炎性因子激活，进而释放大量的NGAL。研究[16]发现, NGAL在脓毒症的诊断、病情评估及预后评估中也扮演着重要角色。国外一项前瞻性研究[17]发现，血浆NGAL对脓毒症急性肾损伤的诊断具有较高的临床价值。本研究结果显示，相较于健康人群，脓毒症患者外周血NGAL水平显著上升; 随着患者病情严重程度的增加，其外周血NGAL水平也有所上升，且NGAL水平与CRP、PCT及APACHE Ⅱ评分、SOFA评分均呈正相关，这也提示脓毒症患者NGAL水平显著上升，并与患者病情程度及炎性反应程度密切相关。

自噬是一种细胞内降解途径，细胞通过自噬回收细胞质，并对缺陷或过量的细胞器进行降解，从而维持体内的稳态。自噬参与炎性反应过程，并在疾病的诊断及病情评估中具有一定的临床价值[18]。研究[19]表明，机体发生感染性损伤后，自噬将出现短暂性升高，随后其表达及活性水平将受到抑制。既往研究[20]证实，脓毒症肝衰竭的标志性事件之一为自噬水平的下降，因此临床上将自噬作为评估炎症性疾病治疗效果的重要指标之一。本研究结果显示，相较于正常人群，脓毒症患者自噬相关基因的表达显著下降，自噬相关基因的表达与患者病情程度及炎性反应程度均呈负相关，提示脓毒症患者体内自噬处于抑制的状态，并与患者病情程度密切相关。本研究结果显示,BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL评估患者预后的AUC均超过0.8, 而3个指标联合评估的AUC超过0.9, 灵敏度及特异度也较高，提示BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA、NGAL联合评估脓毒症患者预后具有较高的临床价值。本研究的不足为: ① 未动态观察各指标变化情况，难以获得连续性资料; ② 研究所纳入样本量较小，且样本来源为单中心。因此，后续仍需开展多中心、大样本研究以进一步验证结论。

综上所述，脓毒症患者NGAL水平显著升高，而BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平显著下降，并与患者病情严重程度及炎性反应密切相关, NGAL、BeclinmRNA、LC3-ⅡmRNA水平在评估患者预后中均具有一定的临床价值。