趋化因子配体13在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义

刘银凤, 袁关利, 刘佳妮, 韩 猛, 吕 骥, 吴梓政

(河北省秦皇岛市第一医院, 1.乳腺外科, 2.呼吸与危重症医学科, 河北 秦皇岛, 066000)

2020年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的数据[1]显示，乳腺癌已取代肺癌成为全球发病率第一的癌症，估计2020年新发乳腺癌病例230万，占所有癌症新发病例的11.7%。三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均呈阴性表达的乳腺癌，通常表现出较高的侵袭性特征，包括较早的复发和转移[2]。由于缺少特异性的治疗靶点，很长一段时间内化学疗法是作为TNBC唯一的全身治疗手段，但其临床效果并不理想，转移性TNBC患者的中位总生存期(OS)仅为12～18个月[2-3]。免疫检查点程序性死亡受体1(PD-1)在多种肿瘤细胞表面表达增加，可帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸，与肿瘤患者预后不良呈正相关[4]。阻断PD-1、程序性死亡受体-配体1(PD-L1)的免疫治疗已应用于TNBC的临床治疗，可部分改善患者的预后，但TNBC 仍是乳腺癌中预后最差的亚型[5]。

肿瘤微环境是肿瘤细胞与机体免疫系统相互作用的主要场景，趋化因子与趋化因子受体之间相互作用将不同的免疫细胞亚群募集到肿瘤微环境中，影响肿瘤的进展和治疗[6]。趋化因子是一类由细胞分泌的信号蛋白或细胞因子超家族，根据氨基端半胱氨酸的排列方式可分为CXC、CC、CX3C和XC共4个大类，趋化因子与趋化因子受体相互作用，诱导特定细胞的定向迁移，在细胞生长、分化、活化和免疫应答中起重要作用[7]。趋化因子配体13(CXCL13)也称B细胞趋化因子-1, 是CXC趋化因子家族成员之一，其特异性受体为CXC亚家族趋化因子受体5(CXCR5)。CXCL13和CXCR5信号通路与肿瘤细胞的生物学功能密切相关，尤其在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的浸润过程中起着至关重要的作用[8]。CXCR5表达于成熟的B细胞、滤泡辅助性T细胞和滤泡树突细胞, CXCL13选择性地与CXCR5结合并控制CXCR5阳性细胞向次级淋巴器官的迁移。因此, CXCL13和CXCR5的相互作用控制着B细胞在形成淋巴滤泡中的定位和结构组织[9]。虽然临床应用免疫检查点抑制剂的目标是恢复耗竭的T淋巴细胞功能，但B细胞也是决定治疗效果的主要因素，推测CXCL13可能在免疫检查点阻断治疗中发挥重要的作用。一项荟萃分析研究[10]也表明, CXCL13是晚期肿瘤患者对免疫检查点抑制剂敏感性的预测指标。本研究应用生物信息学技术挖掘CXCL13 在TNBC中的生物学作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

下载癌症基因组图谱(TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)中132例病理类型为浸润性癌的TNBC组织的转录组数据和患者的临床资料，所有样本均包含完整的高通量测序counts 数据及患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM 分期、生存状态和总生存时间，排除临床分期不明和预后信息不详的患者。

1.2 CXCL13在癌组织中的差异性表达的分析

登录肿瘤免疫评估资源(TIMER)数据库(https://cist rome.shinyapps.io/timer), 进入DiffExp module, Gene Symbol搜索栏输入CXCL13, 分析CXCL13在不同肿瘤组织和对应的正常组织中的表达差异。采用 Wilcoxon test对TCGA 数据库中132例TNBC组织与113例对应正常乳腺组织中CXCL13mRNA的表达情况进行分析。

1.3 CXCL13表达水平与TNBC患者临床病理参数及OS的相关性分析

根据CXCL13表达量的中位数，将TCGA数据库中132个TNBC样本分为CXCL13高表达组66例和CXCL13低表达组66例，采用卡方检验分析2组年龄、肿瘤大小、淋巴结转移情况及TNM 分期的差异，采用Kaplan-Meier法分析并绘制2组OS曲线。应用Kaplan-Meier plotter数据库挖掘CXCL13表达量对TNBC患者OS的影响，再次验证CXCL13表达水平与TNBC患者OS的相关性。

1.4 功能富集分析(GSEA)

从GSEA网站(DOI: 10.107 3/pnas.0506580102, http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)获得了GSEA软件(version 3.0), 根据CXCL13的表达水平将TNBC样本分为高表达组和低表达组，并从Molecular Signatures Database(DOI: 10.109 3/bioinformatics/btr260, http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp)下载了c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt子集合，用于评估相关途径和分子机制，基于基因表达谱和表型分组，设定最小基因集为5, 最大基因集为5 000, 1 000次重抽样,P<0.05、FDR<0.25为差异有统计学意义。

1.5 CXCL13与TNBC中TIL浸润情况及常见免疫检查点表达量的相关性分析

使用TIMER数据库，首先进入Gene module, Gene Symbol搜索栏输入CXCL13, Cancer Types选择BRCA-basal, 计算出CXCL13表达量对B细胞、T细胞(CD8+T细胞和CD4+T细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等细胞浸润情况的影响。进入Correlation module, Cancer Type选择BRCA-basal, Correlation Adjusted by选择None, Gene Symbols(X-axis)输入CXCL13, Gene Symbols(Y-axis)分别输入PD-1、PD-L1和CTLA4, 分析CXCL13表达量与常见免疫检查点PD-1、PD-L1及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)表达量的相关性。

2 结 果

2.1 CXCL13在TNBC组织中的差异性表达

TIMER数据库DiffExp module分析显示, CXCL13在乳腺癌(BRCA)、食管癌(ESCA)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宫内膜癌(UCEC)等肿瘤组织中和皮肤黑色素瘤的转移病灶中呈高表达，而在结肠癌(COAD)、肝细胞癌(LIHC)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、甲状腺癌(THCA)中呈低表达，并且在各分子分型的乳腺癌中，TNBC中CXCL13表达量高于其他亚型乳腺癌。TCGA数据库分析的结果也显示，与对应正常乳腺组织相比, TNBC组织中CXCL13表达量升高(P<0.001)。见图1。

A: TIMER数据库分析结果, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; B: TCGA数据库分析结果。

2.2 CXCL13表达量与TNBC患者临床病理参数及预后的关系

TCGA数据库分析结果表明, CXCL13表达量与TNBC患者年龄、肿瘤大小无相关性，但CXCL13高表达的TNBC患者淋巴结转移比率更低，肿瘤分期为I期的患者比率更高，差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。Kaplan-Meier分析结果显示, CXCL13高表达的TNBC患者的OS高于CXCL13低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05); Kaplan-Meier plotter数据库验证结果显示, CXCL13高表达的TNBC患者OS高于CXCL13低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A: TCGA数据库分析的OS结果; B: Kaplan-Meier plotter数据库分析的OS结果。

表1 TNBC患者CXCL13表达与临床病理资料的关系

2.3 CXCL13表达在TNBC中的生物学功能分析

GSEA结果显示, CXCL13表达主要与B细胞受体通路、T细胞受体通路、抗原加工与提呈通路、细胞因子及其受体相互作用通路显著相关, CXCL13高表达时上述通路相关基因显著富集。见图3。

A: B细胞受体通路; B: T细胞受体通路; C: 抗原加工与提呈通路; D: 细胞因子及其受体相互作用通路。

2.4 CXCL13表达与TNBC 中TIL浸润及常见免疫检查点表达的相关性分析

TIMER数据库Gene module分析结果显示, CXCL13表达水平与巨噬细胞浸润水平无相关性(r=-0.093,P>0.05), 与肿瘤纯度呈显著负相关(r=-0.640,P<0.001), 与B细胞(r=0.643,P<0.001)、CD8+T细胞(r=0.454,P<0.001)、CD4+T细胞(r=0.454,P<0.001)、中性粒细胞(r=0.463,P<0.001)、树突状细胞(r=0.528,P<0.001)的浸润水平呈显著正相关。TIMER数据库Correlation module分析结果显示, CXCL13表达水平与免疫检查点PD-1(PDCD1)(r=0.885,P<0.001)、PD-L1(CD274)(r=0.722,P<0.001)、CTLA4(r=0.847,P<0.001)的表达量呈显著正相关。见图4。

A: CXCL13表达与TIL浸润的关系; B: CXCL13表达与常见免疫检查点表达的关系。

3 讨 论

TNBC是乳腺癌中预后最差的一种亚型，发病率占乳腺癌的15%～20%, 具有分化不良、侵袭性高、生存期短、复发率高等特点。目前, TNBC的临床治疗效果仍不理想，患者的预后仍未得到显著改善[11]。TIMER数据库DiffExp module分析显示, CXCL13在乳腺癌中高表达，尤其在TNBC中表达最高; 对TCGA数据库中的数据进行挖掘也提示CXCL13在 TNBC中高表达，并且CXCL13 高表达与TNBC患者OS的延长显著相关，这提示CXCL13是TNBC预后的预测因子。

免疫治疗是指通过唤醒机体的免疫系统，增强肿瘤微环境中免疫相关细胞的抗肿瘤作用，从而消灭肿瘤细胞[12]。免疫检查点抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的主要手段，主要免疫检查点包括PD-1、PD-L1和CTLA-4[13]。免疫治疗可延长其他实体肿瘤的生存期，是治疗TNBC很有前途的一种治疗策略。既往研究[12]表明, PD-L1在TNBC组织中的表达水平高于非肿瘤组织，免疫调节基因的表达升高以及肿瘤微环境中TIL浸润丰富可改善TNBC患者的预后，这些结果也提示免疫检查点阻断在TNBC的治疗中存在巨大潜力。基于最新公布的随机Ⅲ期临床试验结果[14], 在化疗基础上加用PD-1单抗治疗可部分改善晚期TNBC患者的预后，《中国临床肿瘤学会乳腺诊疗指南(2021版)》和《中国抗癌协会乳腺癌诊疗指南与规范(2021版)》均推荐PD-1抑制剂可联合化疗应用于早期TNBC的新辅助治疗或晚期TNBC的解救治疗，这拉开了TNBC临床免疫治疗的序幕。多种因素均可影响 PD-1单抗的药物疗效，包括肿瘤负荷、PD-L1表达水平、抗原提呈缺陷以及肿瘤微环境中TIL的富集程度、位置、活化程度、免疫效应细胞与免疫抑制细胞的比例等[15-19]。PD-1/PD-L1单抗治疗并非对所有的TNBC患者有效，如何筛选免疫治疗的适用人群、增强免疫治疗的疗效是现阶段TBNC免疫治疗的难点。因此，筛选出能够准确预测免疫治疗反应的分子标志物、开发更好及更有效的免疫治疗靶点以及寻找能够和已有免疫检查点抑制剂协同发挥作用的新靶标对于TNBC的治疗具有重要意义。

本研究使用GSEA软件对CXCL13进行单基因富集分析，结果显示CXCL13高表达可活化B细胞受体通路、T细胞受体通路、抗原加工与提呈通路、细胞因子及其受体相互作用通路，这些通路均参与TIL的分化、迁移和活化等重要的抗肿瘤免疫生物学功能，提示CXCL13在TNBC抗肿瘤免疫应答中发挥着多重效应。在TIMER数据库中的分析发现, CXCL13的表达与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润水平呈显著正相关，提示CXCL13高表达不仅可以改善TNBC患者的预后，而且在TNBC肿瘤微环境中TIL的浸润过程中发挥着重要作用。在TIMER数据库中进一步挖掘发现, CXCL13表达水平与最常见的免疫检查点PD-1、PD-L1和CTLA4的表达量呈显著正相关，提示CXCL13的表达水平可能影响PD-1/PD-L1和CTL4单抗治疗TNBC的效果。本研究使用生物信息学工具对CXCL13在TNBC中的作用进行了深度探索，但仍需要大量基础及临床实验对本研究预测的结果进行验证，为CXCL13作为TNBC预后预测因子提供实验证据和理论依据。

综上所述, CXCL13或有作为预测TNBC患者预后分子标记物的潜力，其可能通过调控肿瘤微环境中TIL的定位、浸润和活化程度，增强抗肿瘤免疫应答，协同免疫检查点抑制剂在TNBC的免疫治疗中发挥重要作用。