血清检测miR-221及miR-27b 对慢性心力衰竭患者诊断及预后的评估价值

朱锁梅，丁海琴，徐燕濡

(南通大学附属如皋医院 急诊科, 江苏 南通 226500)

慢性心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)是多种心脏疾病的终末期综合征，近年来，该病的发病率逐年增加，且此病在发展中常伴有动脉硬化等，死亡率高[1-2]，目前对CHF的诊断准确率较低，影响患者的治疗并加大治疗难度[3]。研究发现，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在多种心肌疾病中特异性表达，如冠心病、心肌肥厚、心肌梗死等[4]。微小核糖核酸-221(microRNA-221，miR-221)、微小核糖核酸-27b(microRNA-27b，miR-27b)属于miRNA家族，miR-221在机体内广泛存在，参与肿瘤的产生及发展全过程，与心脑血管疾病也有一定的联系，影响动脉硬化、心肌梗死等疾病的产生及发展[5]。虽然对miR-27b促进心肌肥大机制并没有达到共识，但在细胞实验中发现与miR-27b共培养的心肌细胞明显比没有加入miR-27b培养的心肌细胞肥大；在病毒性心肌炎动物模型中也发现了抑制miR-27b表达后可减少心肌细胞凋亡[6]。目前已有研究miR-221、miR-27b的表达水平 在冠心病、心肌缺血再灌注、心肌肥厚、心肌梗死的诊断中具有较高的价值[7]。本研究血清miR-221及miR-27b表达水平对CHF患者诊断及预后的评估价值。

1 对象与方法

1.1 一般资料

将2017年1月—2019年1月接受治疗的CHF患者120例作为CHF组，其中男69例、女51例，平均(63.48±5.22)岁；另取20例健康志愿者作为对照组，其中男16例、女14例，平均(61.32±6.18)岁。本次实验获医院医学伦理委员会审批(批号20200214)，患者及家属对本次实验知情并同意。CHF组纳入标准：(1)符合疾病诊断标准[8]，临床症状表现为休息或运动时出现呼吸困难、乏力、双下肢浮肿、纳差、尿少甚至无尿等，以劳力性气促、浮肿为典型临床表现；(2)经血液N末端B型利钠肽原、血肌酶、血常规、肝肾功能、电解质检测，心电图、胸部X线、心脏多普勒超声及心脏核磁共振检查确诊为CHF患者；(3)意识清晰；(4)无免疫相关疾病者。CHF组排除标准：(1)急性冠脉综合征;(2)患有甲状腺功能亢进性心脏病、围产期心肌病、心肌致密化不全等疾病;(3)严重瓣膜性心脏病者;(4)感染性疾病者;(5)肝肾功能不全者。

1.2 研究方法

1.2.1检测血清miR-221、miR-27b水平 取CHF入院当天及对照组被检者空腹静脉血5 mL，800 r/min离心5 min。trizol 试剂提取总RNA，通过MiR Base数据库获取微小miR-221、miR-27b相关成熟序列，设计引物，采用实时荧光定量法检测miR-221、miR-27b纯度和浓度，用2-ΔΔCt计算miR-221、miR-27b的相对表达量，试剂盒武汉致众科技股份有限公司生产。

1.2.2CHF不同心功能分级患者的miR-221、miR-27b水平 120例CHF患者按照心功能NYHA分级[16]分为Ⅰ～Ⅳ 级，其中Ⅱ级32例、Ⅲ 级59例、Ⅳ 级29例，检测CHF不同心功能分级患者miR-221、miR-27b水平，检测方法同1.2.1。

1.2.3CHF不同心功能分级与miR-221、miR-27b的相关性 采用皮尔森相关系数分析CHF不同心功能分级与miR-221、miR-27b相关性。

1.3 CHF患者临床资料单因素分析

收集并记录120例CHF患者吸烟史、高血压史、冠心病史及糖尿病史等各项资料，对患者预后进行分析。

1.4 Logistic回归分析及预后效能分析

对CHF患者的预后生存进行微信、电话、门诊复诊等方式随访，随访时间为2019年1月—2020年12月，记录CHF患者的生存率，并根据患者生存情况分为存活组与死亡组进行单因素分析、多因素分析及预后效能分析，同时分析miR-221、miR-27b对CHF患者预后诊断效能。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 血清中miR-221、miR-27b的表达

与对照组比较，CHF组患者血清中miR-221、miR-27b水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与健康组比较，P<0.05。

2.2 miR-221、miR-27b在CHF不同心功能分级患者中的表达

血清中miR-221、miR-27b在心功能Ⅱ 级患者中的表达低于Ⅲ 级患者，Ⅲ 级患者中的表达低于Ⅳ 级患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-221及miR-27b在CHF不同心功能分级患者中的表达

2.3 miR-221、miR-27b与CHF不同心功能分级患者的相关性

相关性结果显示，血清中miR-221、miR-27b表达与CHF患者心功能分级呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)，提示miR-221、miR-27b水平随CHF患者心功能下降而升高。见表2。

表2 CHF患者血清miR-221、miR-27b与心功能分级相关性

2.4 影响CHF患者死亡的单因素分析

2年的随访结果显示，将 120例CHF患者中死亡的28例患者(23.33%)分为死亡组，存活的92例(76.67%)患者分为存活组，并进行单因素分析。结果显示，120例CHF患者在性别、糖尿病史、吸烟史等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在高血压史、冠心病史、心功能分级及肾损伤中比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与存活组比较，死亡组患者血清中miR-221、miR-27b表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 影响CHF患者死亡的单因素分析

2.5 影响CHF患者死亡的多因素分析

多因素分析结果显示，心功能分级、血清miR-221、miR-27b水平是影响患者死亡的独立风险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响CHF患者预后的多因素分析

2.6 miR-221、miR-27b对CHF患者预后效能的评估价值

miR-221与miR-27b灵敏度及特异度较好，对CHF疾病预后具有较高的诊断价值。见图3、表5。

图2 miR-221、miR-27b诊断CHF患者预后的ROC曲线

表5 miR-221、miR-27b对CHF患者预后的评估价值

3 讨论

多种疾病的产生及发展中都有异常表达的miRNA参与其中。miRNA相关成员可从细胞中被释放至血液中，并跟随血液进行循环，因此可成为多种疾病诊断及预后的标志，根据早期的诊断进行治疗，减少患者2年内死亡率。大量报道提示[9]，miRNA通过调控心肌细胞的凋亡、肥大等参与CHF的产生及发展。郭美姿等[10]运用85例冠心病患者进行实验发现，miR-221在冠心病患者体内表达异常升高，并与冠心病患者心功能分级呈正相关关系，对该病的诊断及预后具有一定价值。心衰的发生、发展是一个复杂的病理生理过程，心肌肥厚在早期起到了重要的代偿作用。前期实验研究已经证实mir-221的过度表达诱导体外心肌细胞肥大，miRNA对心脏重塑的调节至关重要[11]。M Su等[12]在实验中证实了，mir-221在小鼠体内的心脏中特异性过度表达，导致了心脏功能障碍和心力衰竭，表现为严重的心脏增大、间质纤维化增加和心功能受损，同时还表明mir-221是心脏稳态和重构的重要调节因子，是治疗心力衰竭的潜在靶点。孙健俊等[13]运用67例病毒性心肌炎患儿进行研究发现，在病毒性心肌炎中miR-221表达显著高于健康儿童，并与心肌损伤呈正相关。在体外培养心肌细胞的实验中，于心肌细胞中转染miR-221mimics或miR-221siRNA研究其对心肌细胞凋亡的影响发现，转染miR-221mimics后凋亡增加，转染miR-221siRNA后可显著抑制凋亡[14]。本实验显示，miR-221在CHF患者中异常高表达。此外，ROC曲线结果提示miR-221对CHF的灵敏度为89.36%、特异度为74.53%，具有一定的诊断价值；相关性结果同样证实了miR-221表达与心功能分级呈正相关。这提示，miR-221可能是CHF患者的血清标志物。miRNA可调控基因的表达。miRNA的研究已经在血液系统、消化系统、肿瘤、心脑血管等众多领域取得了突破性进展。miRNA 中 miRNA-27 家族分miRNA-27a、miRNA-27b两种亚型，它与多种疾病的发展有关，尤与肿瘤的发生、骨的代谢及心脑血管病联系密切[15]。王燕等[16]在研究中提出，miR-27b在老年左心室肥厚患者中异常高表达，并通过ROC曲线证实，其对心肌肥厚具有一定的诊断价值。刘刚等[17]运用大鼠建立病毒性心肌炎，并给予miR-27b抑制剂干预发现，低表达的miR-27b可抑制心肌细胞凋亡。Ellis K L等[18]运用32例CHF患者进行分析，发现miR-27b对CHF的特异度及灵敏性均较高，对该病具有一定的诊断价值。上述结论均证实了miR-27b在心血管疾病中，尤其是心脏疾病中具有重要的治疗作用。为了证实其的诊断价值，本研究运用RT-PCR检测了miR-27b表达发现，miR-27b水平在CHF患者体内异常升高。此外，ROC曲线面积结果显示miR-27b对CHF的灵敏度为92.24%、特异度为72.68%，具有一定的诊断价值。这提示，miR-27b可能是CHF患者的血清标志物。

为了进一步研究miR-221、miR-27b对CHF患者预后的影响，本实验研究了影响CHF患者死亡的风险因素发现，高血压史、冠心病史、心功能分级、肾损伤、miR-221、miR-27b是影响CHF患者死亡的风险因素，其中心功能分级、miR-221、miR-27b是影响CHF患者预后的独立风险因素。这提示了，miR-221、miR-27b表达对CHF患者具有一定的预后价值。此外，pearson相关性分析提示miR-221、miR-27b与心功能分级呈正相关关系，进一步证实了miR-221、miR-27b对CHF预后的影响。已有研究证实miR-221、miR-27b对心肌肥厚、心肌炎、心肌梗死等的诊断及预后具有一定的价值，虽然关于其在心力衰竭中的研究较少，但在本研究中，明确检测miR-221、miR-27b在CHF中异常高表达。这提示miR-221、miR-27b对CHF均具有一定的诊断价值，且其水平影响患者的预后。

综上所述，在CHF中miR-221、miR-27b为异常高表达，与患者的心功能分级呈正相关关系，及时的检测miR-221、miR-27b有助于对CHF的诊断并改善预后。