抑制AngⅡ受体对糖尿病肾病的作用及JAK2/STAT3/SOCS1通路的影响

陆萍，蔡珣，石向丽, 冉江华，李爱红

(南通大学附属如皋医院 血液科, 江苏 南通 226500)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是长期高血糖导致肾损害的结果，是糖尿病微血管并发症之一，又称为糖尿病性肾小球硬化症，是以进行性蛋白尿、高血压和进展性肾衰竭为特征的一组临床综合征[1-2]。虽有研究表明，随着糖尿病健康管理的加强，与糖尿病相关的心血管疾病的发病率逐渐降低，但这些对终末期肾病发生率的影响较小[3]。目前临床上治疗DN常采用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)受体拮抗药物[4-5]，其中血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)是目前研究最透彻的受体[6]。研究发现，AT1R拮抗剂联合中药免疫抑制剂对早中期的DN有一定的临床疗效[7]，但关于单独使用AT1R拮抗剂对DN的作用机制报道较少。Janus激酶/信号转导和转录活化因子(jauns kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路参与多种慢性炎症性疾病的发生发展[8]。研究发现，细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine cignaling，SOCS)是JAK/STAT信号通路中重要的负性调控蛋白之一[9]，可介导多种疾病的发生发展。有文献显示，SOCS1能通过抑制JAK2的活性诱导STAT3发生磷酸化，进而发挥生物学作用[10]。本研究通过用血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂干预糖尿病肾病大鼠，观察其通过调控JAK2/STAT3/SOCS1信号通路对DN大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 雄性SD大鼠均从青岛市实验动物和动物实验中心购买，共计35只，动物许可证号SCXK(鲁)2016-0002。大鼠均为SPF级，体质量200～220 g，所有大鼠饲养在统一的动物房内，保持室内温度20～25 ℃，光照12 h循环1次，大鼠自由饮食饮水。

1.1.2试剂和仪器 缬沙坦(南京长澳制药有限公司，批号180925)，小鼠抗JAK2单克隆抗体、兔抗p-JAK2多克隆抗体(美国Millipore公司)，STAT3抗体、p-STAT3抗体(上海博湖生物科技有限公司)，兔抗SOCS1多克隆抗体(美国Immunoway公司)，DAB显色试剂盒(武汉博尔夫生物科技有限公司)，NAW1-XTY5血糖测定仪[博邦方舟医疗科技(北京)有限公司]。

1.2 研究方法

1.2.1动物分组和DN模型制备 将35只实验大鼠随机分为3组，即NC组(健康大鼠不做任何干预，正常饲养)10只，DN组(糖尿病肾病大鼠模型组)和ARB组(DN组基础上灌胃缬沙坦干预治疗)共25只。将DN组和ARB组大鼠制备DN模型，大鼠均用高脂高糖饲料喂养4周后，大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)用0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液pH4.4配制(剂量为30 mg/kg)；4周后，连续3次测定大鼠随机血糖值，结果>16.7 mmol/L且24 h蛋白尿≥30 mg/L即为造模成功；造模后有5只大鼠造模失败剔除，剩余20只大鼠每组10只。造模成功后，NC组和DN组大鼠均灌胃等体积的生理盐水，ARB组大鼠灌胃40 mg/kg·d缬沙坦干预，各组大鼠均连续干预8周。

1.2.2生化指标检测 灌胃第8周末收集各组大鼠尾尖血，置于离心机离心10 min(3 000 r/min)，收集上层血清，血糖测定仪测定各组大鼠空腹血糖(first fasting blood glucose，FBG)，测定血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平；同时分别用代谢笼收集大鼠24 h尿液，测定大鼠24 h尿蛋白总量(24-hour urine total protein quantity，24 hUTP)和尿微量白蛋白(Urine micro albumin，UmALB，全自动生化分析仪)。

1.2.3肾组织形态学观察 取血尿后标本后，处死各组大鼠并取出肾皮质，置于甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋组织，将组织切成4 μm 薄片HE染色，显微镜下观察组织学变化。

1.2.4蛋白质印迹检测肾皮质组织匀浆 中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表达 取出肾皮质组织，冰上裂解并研磨组织呈组织匀浆，用BCA法测定总蛋白浓度。电泳蛋白样品，后转移至PVDF膜转上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，用PBS稀释后添加一抗JAK2(1∶1 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、SOCS1(1∶1 000)、GAPDH(1∶500)抗体，4 ℃环境孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，20 min/次，共3次；加入PBS稀释辣根过氧化物酶标记的二抗IgG(1∶5 000)室温孵育1.5 h。洗膜样品后用显微镜观察蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 FBG、TG水平

与NC组比较，DN组大鼠血清FBG和TG水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与DN组比较，ARB组大鼠FBG和TG水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为大鼠FBG水平，B为大鼠TG水平；(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05。

2.2 Scr、BUN水平

与NC组比较，DN组大鼠血清中Scr、BUN水平均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与DN组比较，ARB组大鼠血清中Scr、BUN水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为大鼠Scr水平，B为大鼠BUN水平；(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05。

2.3 UmALB、UTP水平

与NC组比较，DN组大鼠血清中UmALB、UTP水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与DN组比较，ARB组大鼠血清中UmALB、UTP水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：A为大鼠UmALB水平，B为大鼠UTP水平；(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05。

2.4 肾皮质组织学观察

与NC组比较，DN组大鼠肾小球体积增加，系膜细胞数量变多，肾小球上皮细胞形成大量空泡；与DN组比较，ARB组大鼠肾小球形态区域正常，基底膜轻微增生，肾小管排列区域整齐，病变程度模型减轻。见图3。

图4 各组大鼠肾皮质组织学特点(HE，×200)

2.5 肾皮质组织匀浆中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表达

与NC组比较，DN组大鼠肾皮质组织中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值明显升高，SOCS1蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与DN组比较，ARB组大鼠肾皮质组织中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值显著降低，SOCS1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明AT1R拮抗剂可影响DN大鼠肾皮质组织中JAK2/STAT3/SOCS1蛋白表达水平。见图5。

注：A为大鼠肾皮质组织中p-JAK2、JAK2蛋白表达，B为大鼠肾皮质组织中p-STAT3、STAT3蛋白表达，C为大鼠肾皮质组织中SOCS1蛋白表达，D为p-JAK2/JAK2，E为p-STAT3/STAT3，F为SOCS1蛋白表达；(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05。

3 讨论

DN是众多糖尿病并发症中最常见且最严重的并发症糖尿病(DM)，其以血管损伤所致肾小球病变为主要病理特征[11]。有学者研究发现，控制糖尿病肾病患者血糖，改善血流动力学变化，不仅能有效延缓微量蛋白尿的发生，而且还能减少已有微量蛋白尿患者的临床蛋白尿症状[12]。研究发现，肾素血管紧张素系统(RAS)的激活可导致足细胞损伤，抑制RAS激活对足细胞损伤具有保护作用[13]，进而能有效延缓DN的进展。AngⅡ作为肾素血管紧张素系统的主要效应因子，其在机体血容量、血流动力学及内环境稳态的调节中发挥主导作用，目前已有研究发现，AngⅡ水平在肾内局部升高，其与高血压、糖尿病时肾脏病变的发生发展密切相关[14]。因此本研究采用AngⅡ拮抗剂干预DN模型大鼠，观察其对大鼠的作用机制及相关信号通路的影响。

高糖可通过诱导大鼠肾病病变而降低肾小球的滤过功能，抑制肾功能指标Scr、BUN等的吸收。糖尿病肾病发生过程中伴随着异常的脂质代谢，有学者通过对DN大鼠研究发现，肾小管中有大量的脂质沉淀，通过下调脂质生成基因的表达可减轻糖尿病肾病大鼠的肾损伤[15]。本研究结果显示，DN组大鼠FPG、TG、Scr、BUN、UmALB、UTP水平升高，提示DN模型制备成功。通过给予大鼠AngⅡ拮抗剂发现，AngⅡ拮抗剂对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤有一定修复作用。研究发现，AngⅡ能有效的改善肾小球滤过膜通透性，且AngⅡ能和结合其受体，通过减少滤过膜负电荷起到减弱电荷的屏障作用，进而改变肾小球滤过膜的通透性[16]。

JAKs是STATs信号转导通路上游激酶，其可激活JAKs表达，通过诱导STATs磷酸化而形成STATs二聚体，进而调控核内的基因表达。当JAK/STAT途径被过度激活时，靶细胞的生物学功能会因异常活跃而损伤机体，因此通过抑制JAK/STAT途径的过度激活对维持机体的稳定性有重要作用。SOCS家族是目前研究最多的负性调节因子之一，通过负反馈调节JAK/STAT途径而减轻机体产生过度的免疫反应，一定程度阻止了疾病的进展，同时对组织损伤有一定改善作用。SOCS1能通过其特异性酶活性抑制区域与JAK2相应催化部位结合，从而抑制信号传导，目前SOSl对JAK2/STAT3信号通路的负调控作用已被证实。研究发现，SOCS1能抑制JAK2诱导的STAT3磷酸化，进而发挥生物学作用[17]。本研究结果显示，AngⅡ受体拮抗剂可抑制DN大鼠肾皮质组织中JAK2/STAT3信号通路，提高SOCS1蛋白表达水平，对肾组织具有保护作用。有研究证实，SOCSl可通过负向调节JAK2/STAT3通路抑制STAT3磷酸化的生成，机体中的SOCS1含量随着疾病的加重而增加，进而一定程度减轻炎症损伤[18]。目前，尚无相关文献证实AngⅡ受体拮抗剂可调控JAK2/STAT3/SOCS1信号通路，因此，后续本研究将完善实验内容，通过更多的实验方案证实AngⅡ与JAK2/STAT3/SOCS1表达的相关性。

综上所述，AngⅡ受体拮抗剂能减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤，影响JAK2/STAT3/SOCS1蛋白的表达水平，对肾组织有保护作用，为临床治疗糖尿病肾病提供实验依据。