驳骨止痛膏中药材鉴别与姜黄素的含量测定研究

何步高 林传辉 余关厚 利超媚 汤柏贵

驳骨止痛膏是本院资历丰富的医生经过多年临床试验总结而调配出的一种外用中药制剂(粤药制字Z20110161),功能是对跌打损伤具有较好的效果,成分由大黄、白芷、自然铜、当归、骨碎补、姜黄、栀子、侧柏叶、地黄、续断、威灵仙、防风等组成,将其研磨成粉末后加入油脂性基质凡士林等调制成软膏剂,主要作用是接骨续筋、理气活血、消肿止痛等,用途为治疗各种跌打损伤所致骨折、脱臼、筋伤,血瘀不散,肿胀疼痛等症。为了达到制剂质量标准资料提高的要求,作者参照《中国药典》2015 年版一部大黄、当归、姜黄项的鉴别方法［1］,借助于TLC 方法对药材进行鉴别,HPLC 方法测定姜黄素含量,结果较好。

1 材料与仪器

硅胶G 薄层板(10 cm×10 cm,0.25～0.3 mm,青岛海洋化工有限公司),自制10 cm×10 cm 硅胶G 薄层板(0.3 mm),大黄对照药材(批号：120984-201702),姜黄对照药材(批号：121188-201703),当归对照药材(批号：120927-201713),姜黄素对照品(批号：110823-201004)均购自中国食品药品检定研究院。高效液相色谱仪(美国戴安U3000),UV-1 型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。本院自制20180403、20180602和20180803 批次的驳骨止痛膏。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 大黄 供试品制备：称取20 g 驳骨止痛膏于干净容器内,倒入100 ml 75%甲醇,水浴加热60℃溶解,超声30 min 后冷却,过滤浓缩到20 ml,加1 ml 盐酸,再次水浴20 min,冷却,加20 ml 乙醚混匀萃取2 次,合并乙醚液,水浴干燥直到变成残渣,之后加1 ml 甲醇溶解。

称取大黄对照药材0.5 g,按照相同步骤操作制备对照品。取一硅胶H 薄层板,将上述两种样品各6 μl 点到板上,放在装有展开剂(石油醚∶甲酸乙酯∶甲酸=15∶5∶1)的展开缸中展开,待展开适当长度时取出,放在通风橱中晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,对照品和供试品在相应的位置上有一相同颜色的斑点。见图1。

图1 大黄TLC 图

2.1.2 姜黄 供试品按照2.1.1 方法制备；称取0.5 g姜黄对照药材于干净容器内,加5 ml 无水乙醇,超声1 h,过滤收集滤液,浓缩到1 ml,作对照品。取一硅胶G 薄层板,将上述两种样品各6 μl 点到板上,放在装有展开剂(三氯甲烷∶甲醇=40∶1)的展开缸中展开,待展开适当长度时取出,放在通风橱中晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,对照品和供试品在相应的位置上有一相同颜色的斑点。见图2。

图2 姜黄TLC 图

2.1.3 当归 供试品按照2.1.1 方法制备；称取1 g当归对照药材粉末于干净容器内,加20 ml 乙醚,超声20 min,过滤蒸干,加1 ml 甲醇溶解残渣,作对照品。取一硅胶G 薄层板,将上述两种样品各6 μl 点到板上,放在装有展开剂(正己烷∶乙酸乙酯=4∶1)的展开缸中展开,待展开适当长度时取出,放在通风橱中晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,对照品和供试品在相应的位置上有一相同颜色的斑点。见图3。

图3 当归TLC 图

2.2 HPLC 测定姜黄素的含量

2.2.1 对照品制备 取一干净的50 ml 量瓶,称取10 mg 姜黄素对照品放入瓶中,先加少量的甲醇溶液将其溶解,之后继续加到刻度线,摇匀,取1 ml 以上溶液到20 ml 的量瓶中,加甲醇补足到刻度,摇匀得到对照品储备液,浓度为10.57 μg/ml。

取1 ml 对照品储备液到10 ml 的量瓶中,同样加甲醇到刻度线,摇匀得到对照品溶液,浓度为1.057 μg/ml。

2.2.2 供试品制备 称取1.024 g 驳骨止痛膏到带塞的锥形瓶中,倒入10 ml 甲醇称重,然后60℃水浴超声30 min,自然冷却,再次称重,加甲醇补足到初始重量,混匀,将以上液体过滤,使用直径为0.45 μm 的滤膜,收集为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 取不含姜黄药材的样品,按照2.2.2 操作制备阴性对照溶液。

2.2.4 系统适应性试验考察 分别取10 μl 对照品、供试品和阴性对照溶液用高效液相色谱仪检测。结果表明,供试品的保留时间和峰型与对照品一致,且阴性对照无干扰。见图4。

图4 HPLC 图谱

2.2.5 线性关系 分别取姜黄素对照品储备液0.2、0.6、1.0、2.0、3.0、5.0 ml 到10 ml 量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成浓度为0.2114、0.6342、1.0570、2.1140、3.1710、5.2850 μg/ml 的溶液。各取10 μl 以上溶液注入高效液相色谱仪,按照2.2.4 操作测定,进行回归计算得回归方程：Y=1.4044X-0.0780,r=0.9997。结果表明,进样量在0.002～0.05 μg 范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 取10 μl 姜黄素对照品溶液,按照2.2.4 操作连续进样6 次,RSD 为0.65%,说明精密度很好。

2.2.7 稳定性试验 取驳骨止痛膏供试品溶液10 μl,在0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样,试验结果表明溶液稳定。

2.2.8 重复性试验 称取1 g 驳骨止痛膏,共5 份,按照2.2.2 方法制备,按照2.2.4 操作测定。结果：平均含量8.6597 μg/g,RSD 为0.88%,说明重复性很好。

2.2.9 回收率试验 取驳骨止痛膏(批号：20180403,姜黄素含量8.6597 μg/g)0.5 g,共6 份,分别加入一定量的姜黄素对照品,按照2.2.2 方法制备,之后测定峰面积和计算姜黄素含量。见表1。

表1 姜黄素的加样回收率

2.2.10 样品含量测定 按照2.2.2 方法制备,取供试品和对照品溶液10 μl,计算样品中姜黄素含量。见表2。

表2 姜黄素含量结果

3 小结

采用TLC 对驳骨止痛膏中的大黄［2］、姜黄［3］、当归［4］进行定性鉴别,方法简便、专属性强、重现性好,可作为该制剂的质量标准中质量控制方法。HPLC测定驳骨止痛膏中姜黄素的含量,在验证精密度、稳定性、重复性和加样回收率等方面均较好［5］。该方法可用于驳骨止痛膏的质量控制。