血浆外泌体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平对乳腺癌早期诊断的价值研究

刘 伶，邹世芳，巩 亮，齐 晟，丁 辉，黄 明

（1.江油市人民医院普外科，四川江油 621799；2 四川省医学科学院·四川省人民医院，成都 610072）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是世界范围内导致癌症死亡的主要原因之一。然而，早期乳腺癌的5年存活率可达78%～80%，所以，乳腺癌越早被诊断和治疗，患者存活的时间就越长[1]。随着分子生物学的不断发展，人们对早期诊断的生物标志物也越来越感兴趣，新的生物标志物可以预测疾病的发生，并有助于开发新的治疗靶点。因此，开发更有效的筛查方法和新的治疗靶点对更好地治疗疾病至关重要。近年来，许多研究表明长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，LncRNAs）与乳腺癌的发生发展密切相关[2]。LncRNAs是真核生物基因组中一类长度超过200bp的转录产物，在正常发育和肿瘤发生过程中发挥重要作用[3]。研究发现，与邻近非癌组织相比，宫颈鳞状细胞癌组织中LncRNA膀胱癌相关转录因子1（bladder cancer associated transcript-1，BLACAT1）表达显著升高[4]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是跨膜糖蛋白家族中的一员，其表达与乳腺癌的组织学表型密切相关，可作为评价乳腺癌的指标[5]。外泌体携带的多种LncRNA及蛋白质等成分在肿瘤的发展过程中起着重要的作用，其稳定性高，且易于从血浆、乳汁等体液中收集，能更好地反映肿瘤患者LncRNA及蛋白质等指标的表达，已成为判断乳腺癌的新型生物标 志 物[6]。但LncRNA BLACAT1和E-cadherin在乳腺癌患者血浆外泌体中的表达尚不清楚，因此，本研究通过检测血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平，分析二者对乳腺癌早期诊断的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究的所有样本均取自2019年1月～2020年9月在江油市人民医院就诊的新确诊乳腺癌患者以及年龄和性别相匹配的健康志愿者。我们收集了96例乳腺癌患者的血液样本和75例年龄和性别相匹配的健康对照样本。两组入组对象一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，其中乳腺癌组患者的平均年龄为51.24±18.53岁。纳入标准：①所有患者均被确诊为原发性乳腺癌；②未接受任何术前放疗或化学疗法；③在收集样品前无其他恶性疾病和伤害影响；健康对照组志愿者的平均年龄为47.46±20.16岁。选择的健康志愿者在采血时没有暴露于任何潜在有害的化学物质，也没有任何恶性疾病和任何急性疾病或伤害。该研究得到了江油市人民医院伦理审查委员会的批准，在收集血液之前已获得所有参与者的知情同意。

1.2 仪器与试剂 Exo Quick Exosome Precipitation Solution试剂盒（北京博迈斯科技发展有限公司，货 号：EXOQ5A-1/EXOTC10A-1）；RNA提 取 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：R1200-100）；PrimeScript RT试剂盒（上海百赛生物技术股份有限公司，货号：RR055B）；TB Green Premix Ex TaqTMII试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司，货号：RR820A）；透射电子显微镜（上海思为仪器制造有限公司，型号：YTS110）；分光光度计（上海在途生物科技有限公司，型号：NanoDrop 2000）。

1.3 方法

1.3.1 血浆外泌体的提取和鉴定：乳腺癌患者和对照组志愿者通过抗凝血管收集术前5 ml外周血，然后分离血浆。按照Exo Quick Exosome Precipitation Solution试剂盒说明书方法提取血浆外泌体。提取方法为：将血浆样本500 μl与上述试剂120 μl混合均匀，4℃孵育30 min后离心15 min，转速3 000 r/min，将上清液去除，并加入磷酸盐缓冲液180 μl重悬，得到的即为血浆外泌体。血浆外泌体的鉴定方法：①使用透射电子显微镜观察外泌体的形态；②使用免疫印迹法检测血浆外泌体相关标志物TSG101，CD63的表达。

1.3.2 qRT-PCR检测LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA水平：利用RNA提取试剂盒提取血浆外泌体中总RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度，并使用PrimeScript RT试剂盒反转录成cDNA。RT反应条件：42℃ 2 min，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃10 min，然后将cDNA存储在-20℃条件下。

使用TB Green Premix Ex TaqTMII试剂盒进行qRT-PCR，反 应 条 件 为95℃ 10 min；95℃15s，60℃ 30 s，45个循环；72℃ 1 min。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt对血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平进行相对定量分析。PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料（均符合正态分布）以均数±标准差（±s）表示，行独立样本t检验；计数资料以n表示，行χ2检验。Pearson法分析乳腺癌患者血浆外泌体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表 达 的相 关性；构建受试者工作特性（ROC），并以曲线下面积（AUC）评估血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA进行乳腺癌诊断的可行性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体的鉴定 见图1。透射电子显微镜可观察到血浆外泌体呈球形，直径约90 nm左右。免疫印迹法结果显示，对照组和乳腺癌组血浆外泌体均表达CD63和TSG101，且乳腺癌组较对照组表达水平高。

图1 透射电子显微镜下血浆外泌体的形态

2.2 血 浆 外 泌 体 中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平的比较 与健康对照组相比，乳腺癌患者血浆外泌体LncRNA BLACAT1表达 水 平 显 著 升 高（2.02±0.57 vs 0.99±0.03），E-cadherin mRNA表达水平显著降低（0.65±0.18 vs 1.00±0.04），差异均有统计学意义（t=15.622,16.514,均P＜0.05）。

2.3 LncRNA BLACAT1与E-cadherin mRNA相 关性分析 根据相关性分析结果显示，LncRNA BLACAT1与E-cadherin mRNA的相关系数(r)为-0.274（P=0.007），表明乳腺癌患者血浆外泌体的LncRNA BLACAT1与E-cadherin mRNA水 平 呈 显 著性负相关。

2.4 血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达与临床病理特征的相关性研究 见表2。根据乳腺癌患者体内血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表 达 水 平，分 别将所有乳腺癌患者分为LncRNA BLACAT1高表达组（LncRNA BLACAT1表达水平≥2.02）和低表达组（LncRNA BLACAT1表达水平＜2.02），E-cadherin mRNA高 表 达 组（E-cadherin mRNA表达水平≥0.65）和低表达组（E-cadherin mRNA表达水平＜0.65）。结果显示，血浆外泌体LncRNA BLACAT1的表达水平与乳腺癌患者的TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关（均P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤大小、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）无关（均P＞0.05）。E-cadherin mRNA的表达水平均与乳腺癌患者的TNM分期、ER，PR和分化程度有关（均P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关（均P＞0.05）。

表2 血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达与临床病理特征的相关性（n）

2.5 血浆外泌体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA对乳腺癌的诊断价值 见图2。ROC曲线分

图2 血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA对乳腺癌诊断价值的ROC曲线

析结果显示，血浆外泌体中LncRNA BLACAT1对乳腺癌单独诊断时的AUC为0.839，敏感度和特异度分别为69.80%，89.70%，截断值为2.08（95%

CI：0.759～0.919，P＜0.05）；E-cadherin mRNA单独诊断时的AUC为0.808，敏感度和特异度分别为60.00%，88.50%，截断值为0.48（95% CI：0.719～0.897，P＜0.05）；血 浆 外 泌 体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA联合诊断乳腺癌的AUC为0.941（95% CI：0.896～0.985），敏感度和特异度分别为92.30%，85.60%。

3 讨论

随着社会生活的不断发展、生活方式和饮食习惯的改变以及环境的恶化，乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤[7]，严重影响人们的身心健康。相关统计数据显示，乳腺癌约占女性恶性肿瘤发病率的15%[8]。根据2015年世界卫生组织的报告，女性乳腺癌死亡率显著上升，主要原因是复发和转移以及发病机制不明[9]。因此，乳腺癌的早期发现和诊断是提高治疗效果的关键。

大多数乳腺癌患者预后差是由于诊断晚。目前，组织、基因和血清标记物被用于乳腺癌的诊断，但这些标记物在乳腺癌的早期诊断中作用较小[2]。大量研究发现，包括LncRNAs在内的多种因素和蛋白质参与乳腺癌的发生发展。外泌体是直径40～100 nm的内源性膜小泡，由各种细胞分泌，含有多种物质，包括核酸（例如DNA，mRNA，miRNA，LncRNA）、蛋白质（例如跨膜蛋白和热休克蛋白）和酶[10-12]。本研究血浆中提取的外泌体经鉴定发现，外泌体直径符合要求，可进行下一步研究。因此，本研究通过探讨乳腺癌患者血浆外泌体中LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平，分析其诊断价值，为临床应用提供理论依据。

LncRNA BLACAT1是长度为2 616 bp的未翻译RNA分子，位于人染色体1q32.1，可通过不同的机制调控肿瘤细胞的转移、增殖等过程，与多种疾病有关联[13-14]。CHENG等[4]研究报道，肿瘤组织中LncRNA BLACAT1表达可通过下调微小RNA-424和微小RNA-143促进宫颈鳞状细胞癌的侵袭和转移。WANG等[15]研究发现，与癌旁正常组织相比，胃癌组织和细胞中LncRNA BLACAT1表达均上调。本研究也得出与既往研究[15]相似的结果，即血浆外泌体LncRNA BLACAT1表达升高可能与乳腺癌的发生有关，同时发现其与乳腺癌患者的TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关。提示LncRNA BLACAT1表达变化可能通过影响肿瘤TNM分期、淋巴结转移和分化程度而在乳腺癌进展中发挥作用。研究显示在非小细胞肺癌中，LncRNA BLACAT1高表达患者的总生存期和无进展生存期均较LncRNA BLACAT1低表达患者短，LncRNA BLACAT1表达升高与非小细胞肺癌患者预后独立相关[16]。但LncRNA BLACAT1表达是否可作为判断乳腺癌的指标尚有待验证。因此，本研究绘制了诊断乳腺癌的ROC曲线，结果显示血浆外泌体中LncRNA BLACAT1对乳腺癌单独诊断的敏感度和特异度分别为69.80%，89.70%，认为血浆外泌体LncRNA BLACAT1表达可作为潜在的分子标志物用于乳腺癌早期诊断。

E-cadherin是钙黏蛋白家族的成员之一，是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，主要表达于上皮细胞。它由染色体16q22.1上的钙黏蛋白-1（Cadherin-1，Cdh1）基因编码，分子量约为120 000[17]。E-cadherin介导同种异体上皮细胞的黏附，在上皮细胞聚集和黏附以及维持上皮形态结构完整性方面发挥重要作用，是介导上皮细胞黏附的最重要分子[18]。已有报道称，E-cadherin作为一种肿瘤抑制因子，其表达对肿瘤的进展、侵袭和转移有很强的抑制作用，且它在正常乳腺组织中高表达，在乳腺癌组织中表达下调[19]。本研究中，与健康对照组相比，乳腺癌患者血浆外泌体的E-cadherin mRNA表达水平明显下调，与TAVAKOLIAN等[19]研究具有相似性；同时发现，E-cadherin mRNA的表达水平与乳腺癌患者的TNM分期、ER，PR和分化程度有关。ER也是乳腺癌内分泌治疗的靶点和良好的预后指标，E-cadherin mRNA表达与ER呈正相关，表明E-cadherin mRNA在乳腺癌患者血浆外泌体中的表达变化可能与ER参与临床病理有关，但相关机制仍需进一步研究。此外，研究还得出E-cadherin mRNA对乳腺癌单独诊断的敏感度和特异度分别为60.00%，88.50%，提示血浆外泌体E-cadherin mRNA表达是诊断乳腺癌的可靠指标之一。

上 皮 间 质 转 化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）被认为是侵袭性和转移性癌细胞扩散的根源，E-cadherin是此过程中的重要参与者，可形成建立和维持细胞间相互作用的结构[20]。XU等[16]研究报道，LncRNA BLACAT1低表达时E-cadherin表达增加，可通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制非小细胞肺癌转移和EMT。本研究相关性分析结果显示，血浆外泌体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平呈负相关，提示二者可能通过参与Wnt/β-catenin等多种致癌信号通路在乳腺癌中发挥作用，今后需要深入探讨。进一步使用ROC曲线分析发现，LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA联合诊断的AUC为0.941，且敏感度高达92.30%，表明联合检测可提高诊断乳腺癌的敏感度，具有更好的诊断价值。

综上所述，血浆外泌体LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA表达水平对乳腺癌的早期诊断有一定的临床价值。而且，LncRNA BLACAT1和E-cadherin mRNA联合检测比单独检测有更好的诊断价值，可提高敏感度，有望成为未来乳腺癌诊断的有效指标，但其相关的作用机制仍需进一步研究。