铁皮石斛多糖的分离纯化及抗衰老活性研究

赵苑伶 张 雪 陈林珍 刘 妍 刘 静 赵崇军 刘永刚 马志强

(1 北京中医药大学中药学院，北京,100102； 2 中药品质评价北京市重点实验室，北京,100102)

铁皮石斛因具有铁绿色的外表皮而得此名称，是铁皮石斛(一种兰科植物)的干燥茎[1]。其神奇独特的药用价值深受历代医家推崇，是皇家御用圣品[2]。它有着清热滋阴与生津益胃等方面的良好功效，大量的数据显示，它的主要功效还包括抗氧化、抗肿瘤以及调节人体的免疫系统等，可以有效地治疗消化道疾病、肝胆类疾病和糖尿病等[3]，铁皮石斛主要含有多糖、芪类、氨基酸、矿质元素、生物碱、挥发油等多种化学成分[4-10]，而多糖作为其主要活性成分，具有改善抗氧化、调节免疫、延缓衰老等作用[11]。

多糖具有的多种生物活性与其结构密切相关，不同的结构有着不同的活性[12]，多糖的构型、分子量等都是影响其活性的主要因素，近年来，对铁皮石斛多糖(Dendrobium Officinale Polysaccharides，DOP)的药理活性研究主要集中在粗多糖，对分离纯化后的多糖药理活性研究较少，而在多糖的药理活性中，抗衰老作用不仅具有重要的药用和保健价值，也是中药多糖活性的研究热点，但纯品铁皮石斛多糖抗衰老作用的研究却较为少见。抗衰老活性研究中，常用的动物模型有D-半乳糖致衰老小鼠模型、斑马鱼、果蝇和秀丽隐杆线虫模型等，秀丽隐杆线虫是抗衰老药物及抗衰老功能因子研究的理想模型[13-14]，因其生命周期短，可模拟自然衰老，体积小，产卵量大，体内大部分基因与人类基因同源，具有高度保守性等特点，已经成为研究衰老调控机制十分有用的模式生物之一[15]。研究常以其自然寿命、生殖能力、抗氧化损伤能力及脂质含量等作为指标，来评价药物的抗衰老作用。因此，本文通过分离纯化得到铁皮石斛纯品多糖DOP-1，同时采用秀丽隐杆线虫作为所需的研究模型，深入地探讨DOP-1所具有的抗衰老功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 大肠杆菌E.coli OP50、野生型秀丽隐杆线虫株N2由中国科学院遗传与发育生物学研究所惠赠，野生型秀丽隐杆线虫株N2于22 ℃生化培养箱中培养。

1.1.2 药物 铁皮石斛药材(乐清枫之灵健康科技有限公司，批号：20200921)。

1.1.3 试剂与仪器 葡聚糖标准品Mw1000、5000、12000、50000、270000、670000(阿拉丁公司，批号分别为A2009198、C2111186、A2125476、D2016056、E2008104、D2027059)，DEAE-Sepharose Fast Flow(索莱宝公司，批号：20210317)，HW-55F(东曹生物科技有限公司，批号：55HWFB005FA)，线虫生长培养基(Nematode Growth Medium，NGM)(上海瑞楚生物科技有限公司，批号：20210706)，LB液体培养基(索莱宝公司，批号：20210716)，琼脂粉(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20210613)，磷酸二氢钠(天津市光复科技发展有限公司，批号：20200402)，磷酸二氢钾(天津市光复科技发展有限公司，批号：20201105)，氯化钠(天津市大茂化学试剂厂，批号：20210115)，硫酸镁(福晨化学试剂有限公司，批号：20200401)，次氯酸钠(福晨化学试剂有限公司，批号：20210525)等均为分析纯；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE)、B5-2磁力搅拌器(常州荣华仪器制造有限公司，型号：B5-2)、恒流泵(上海青浦沪西仪器厂，型号：HL-2B)、自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂，型号：BS-160A)、冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司，型号：SCIENTZ-10ND)、体视显微镜(Nikon公司，日本，型号：SMZ 745)、荧光显微镜(Nikon公司，日本，型号：TS-2)、生化培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司，型号：SPX-250)、万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：MS105DU)、高压蒸汽灭菌器(松下健康医疗器械株式会社，日本，型号：MLS-3751L)。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛多糖的制备 铁皮石斛药材取100 g，加入15倍体积水回流提取1.5 h/次，共计3次，合并提取液并抽滤，浓缩至适量体积后，除去色素、淀粉及小分子杂质后，将透析液浓缩至原药材量的0.8倍，加入95%乙醇至浓缩液含醇量为85%，通过去离子水透析48 h，在4 ℃的温度下进行12 h的醇沉，然后进行离心处理，时间为20 min，转速为4 000 r/min，之后将沉淀取出来，放置于真空干燥箱进行干燥，得到铁皮石斛粗多糖。

1.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow柱分离 取铁皮石斛粗多糖500 mg，将其溶于10 mL去离子水中，用微孔滤膜过滤，去除杂质，上清液用DEAE-Sepharose Fast Flow进行离子柱层析进行洗脱，用去离子水作为洗脱液[16]。自动收集器收集洗脱液，并用酶标仪进行检测，对以上的多糖部位进行收集，浓缩，透析，干燥。得到干燥的水溶性多糖部位。

1.2.3 HW-55F凝胶柱纯化 将上述得到的水溶液铁皮石斛多糖100 mg溶于10 mL去离子水中，用微孔滤膜过滤，去除杂质，上清液用HW-55F凝胶进行柱层析进行洗脱，用去离子水作为洗脱液。自动收集器收集洗脱液，酶标仪进行检测，浓缩，透析，干燥，得到干燥的多糖部位，命名为DOP-1。

1.2.4 铁皮石斛多糖的均一性鉴定及相对分子质量测定 采用高效凝胶渗透色谱法(High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC)测定DOP-1的分子量和纯度，配置1 mg/mL的葡聚糖标准品，以纯净水作为流动相进行检测，采用TSK G4000 PWXL(300 mm×7.8 mm，10 μm)型号的色谱柱，流速设置为1 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为20 μL，检测器采用视差折光检测器。根据葡聚糖的标准品的保留时间建立标准曲线及公式，配置1 mg/mL的多糖样品溶液进行检测。

1.2.5 秀丽隐杆线虫的基本培养 配制新鲜NGM，过夜后，在培养基上均匀地涂布OP50大肠杆菌，培养基边缘留出约0.5 cm为无菌区，涂布后的培养皿于37 ℃过夜培养。通过灭菌手术刀将一部分旧培养基(其中含大量线虫)切下来，采用倒置的方式放于培养基表面上，然后在22 ℃进行静置培养处理，每隔一段时间即进行更换。

1.2.6 线虫的寿命实验 参考文献[17]的方法，收集同期化L4期线虫至配制涂布OP50大肠杆菌的不同浓度DOP-1溶液(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)NGM，根据研究需要设置以不含DOP-1溶液的NGM培养基为对照组，在培养基当中添加五氟尿嘧啶，其浓度为200 μmol/L，以对线虫的繁殖过程进行有效的抑制。将线虫挑选处理并放到准备好的培养基之上，线虫数量为30条/板，3板/组。记L4期给药为第0天，每隔1 d即进行1次的定点计数，将正常死亡线虫挑出来，并且将异常的去除掉[18]。该过程持续到所有线虫均已死亡，然后不再计数，该过程共重复3次，然后绘制寿命曲线。所采用的死亡标准具体如下：通过挑虫器来对其头尾部进行多次轻触，如果没有反应，则可认为其已经死亡。

1.2.7 线虫的生殖实验 结合参考文献[19]所提出的方法，按照上述方法操作，每组培养板上放置1条线虫，放入培养箱中培养，当完成实验后，则定期转移到新培养板上，且将原有培养板保留下来，并于次日开展计数工作，将产卵量记录下来，实验共持续5 d[20]。

1.2.8 线虫的急性热应激实验 结合参考文献[21]所提出的方法，按照上述方法操作，将线虫挑选处理并放到准备好的培养基之上，线虫数量为30条/板，3板/组。给药培养3 d，将线虫挑出来并且转至新培养基里，然后在37 ℃下进行观察。每隔1 h即进行1次计数，将已经死亡的线虫挑出来并统计数量。该过程持续到全部线虫死亡，实验总共重复3次。

1.2.9 线虫的氧化应激实验 结合参考文献[22]所提出的方法，按照上述方法操作，在含浓度为600 mmol/L的百草枯溶液的培养基中放入培养好的各组线虫，线虫数量为30条/板，3板/组。此外，每隔2 h即进行1次定点计数，将已经死亡的线虫挑出来并进行计数。该过程持续全部线虫死亡，实验总共重复3次。

1.2.10 线虫的脂褐素实验 结合参考文献[23]所提出的方法，按照上述方法培养5 d，将培养好的线虫挑出，30条/组，麻醉，制片，荧光显微镜下观察拍照(紫光激发，蓝光发射)，实验总共重复3次。

2 结果

2.1 铁皮石斛多糖的纯度及相对分子质量分析 铁皮石斛纯化多糖的HPGPC结果显示，分离纯化后的多糖组分洗脱曲线形态对称，存在着较为单一的峰形特征，并且具有比较高的纯度(纯度达到了98%)。根据HPLC检测结果和GPC软件所得数据综合分析，可绘制出样品的示差色谱图。利用已知葡聚糖标准品的分子量对数为纵坐标，HPLC所显示的保留时间为横坐标，根据DOP-1的液相图中的保留时间，可计算得出铁皮石斛纯品多糖的相对平均分子量是DOP-1(Mw)﹕3.260×105。见图1。

图1 铁皮石斛多糖高效凝胶色谱图

2.2 DOP-1对线虫寿命的影响 不同浓度的DOP-1均能延长线虫的寿命，差异有统计学意义(均P<0.05)，并使线虫的生命曲线右移，对照组和DOP-1低浓度、中浓度、高浓度组线虫的平均寿命分别为(13.12±0.59)d、(16.51±0.60)d、(18.81±0.51)d、(17.49±0.45)d。且当DOP-1的浓度为200 μg/mL时，与对照组比较，寿命提高了43.37%，延长寿命效果更为显著。见图2。

图2 DOP-1对秀丽隐杆线虫寿命的影响

2.3 DOP-1对线虫生殖能力的影响 与对照组比较，在100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的DOP-1当中，其产卵量基本接近，而且差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 DOP-1对线虫产卵数的影响

2.4 DOP-1对线虫抵抗外界急性热应激能力的影响 与对照组比较，各个浓度条件(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的DOP-1组具有显著更高的存活率，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 热应激下DOP-1对线虫寿命的影响

2.5 DOP-1对线虫急性氧化应激的影响 经不同浓度的DOP-1处理后，秀丽线虫在经历百草枯急性应激时其生存能力显著高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图5。

图5 氧化应激下DOP-1对线虫寿命的影响

2.6 DOP-1对秀丽线虫体内肠脂褐质的影响 利用荧光显微镜可观察到线虫体内的脂褐素发出的蓝色荧光。见图6。通过荧光密度的计算，发现不同浓度的DOP-1均能降低线虫体内脂褐素的积累，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图6 荧光照射下，线虫体内产生的蓝色荧光

图7 DOP-1对秀丽隐杆线虫脂褐素荧光强度的影响

3 讨论

多糖是铁皮石斛的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗衰老作用。分离纯化铁皮石斛多糖，得到均一多糖，并研究其药理活性，有利于对其化学结构和药理活性之间关系的研究提供思路。本实验以铁皮石斛鲜品为原料，通过水提醇沉获得粗多糖，然后经过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱和HW-55F凝胶柱进行分离纯化，获得了纯化的铁皮石斛多糖DOP-1。通过凝胶渗透色谱法对DOP-1进行分析，结果表明中铁皮石斛多糖为均一性多糖，相对分子质量为3.260×105。

衰老指的是有关的机体功能丢失并逐步地丧失了适应周围环境的能力，该过程涉及到不同因素的影响与控制，截至今日，尚未探明其具体的生物学机制。氧化应激、细胞老化和慢性炎症都可能是诱导衰老的因素[24-25]。本研究以秀丽隐杆线虫为模式生物，对DOP-1的抗衰老活性进行研究，主要研究其寿命、生殖能力及抗氧化损伤能力等。对于抗衰老作用研究，自然寿命是其首选分析指标，能直接观察药物对其寿命的影响，本研究发现不同浓度的DOP-1均能提高秀丽隐杆线虫寿命，且浓度为200 μg/mL的DOP-1效果最显著，与对照组比较，线虫寿命增加了43.37%；开展DOP-1对线虫生殖能力的影响这一研究，主要目的是探讨对于延寿方面，DOP-1是否会损害线虫的生殖能力，或者说，在延寿的同时生殖能力是否发生了改变。抗衰老药物应同时具备增加寿命和维持机体正常生理活动2方面的条件，关于增加线虫的寿命作用是否以损害生理功能为代价，不同的抗氧化物质的研究结果不同，需要进行实际的研究[26]。为了评价DOP-1在延缓线虫衰老时是否会对其生殖能力产生不良影响，进行了不同DOP-1浓度处理下线虫产卵后幼虫的数量的实验，结果表明DOP-1对线虫产卵能力没有显著影响，并未使其丧失生殖能力。研究表明，热应激会引起机体氧化还原平衡紊乱，发生氧化应激，损伤细胞，评价体外热应激引起的秀丽隐杆线虫机体损伤的方法是在体外施加37 ℃高温刺激线虫，以在线虫中诱导热应激反应并改善线虫的热应激状态和促进线虫中耐热蛋白的表达，从而提高其自身的耐受能力和增强因热损伤带来的保护作用[27-28]。结果表明在高温压力下，DOP-1能够改善秀丽线虫的热应激状态并提高其耐热激能力，对秀丽线虫具有抗热激损伤保护作用。百草枯毒是一种强氧化剂，在机体进行代谢之后，产生了超氧阴离子自由基，由此造成了机体的氧化损伤。衰老的自由基损伤学说认为维持自由基和氧化应激系统动态平衡的能力可以延缓衰老[29-30]，结果表明在压力环境下DOP-1可以促进秀丽线虫抗氧化蛋白的表达，提高其自身的耐受能力和清除自由基的能力，进而增强了因氧化损伤而带来的保护作用。实验发现DOP-1对37 ℃高温损伤和百草枯诱导的氧化应激损伤均具有一定抵御作用，推测DOP-1可能是通过改善线虫在应激条件下的生存状态而延缓衰老；肠道自发荧光反映了脂褐素的积累，其积累随年龄增长而增多，可作为线虫机体衰老的有效的生物标志[31]，通过荧光检测线虫脂褐素水平发现，DOP-1处理下自发荧光减弱，有效降低了脂褐素的积累，延缓线虫衰老。结果表明DOP-1具有明显的抗衰老的作用。针对DOP-1良好的抗衰老作用，可进一步考虑研究其抗衰老作用机制，以期为铁皮石斛多糖开发成延缓衰老的保健功能食品和药品提供理论依据。