基于网络药理学探讨身痛逐瘀汤治疗腰椎间盘突出症的作用机制

龙水文 贾育松 李晋玉 孙悦礼 郑晨颖 白春晓 张 帆 刘楚吟 邸学士 袁巧妹 冉 宇 陈 江 王拥军

(北京中医药大学东直门医院骨伤科，北京,100700)

腰椎间盘突出症(Lumbar Disc Herniation，LDH)是临床常见的腰椎退行性疾病，其发病与椎间盘纤维环破裂、髓核突出刺激压迫神经根密切相关，临床多表现为腰痛、下肢放射痛及感觉异常[1]。腰椎间盘突出症属于中医学“腰腿病”“痹症”范畴，中医学认为其发病与腰部劳损扭挫、风寒湿邪侵袭等因素相关，其病机在于肝肾不足，或有劳损外伤，或感受外邪，以致经脉痹阻、气血运行不畅，不通则痛，痛有定处。

身痛逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》，具有活血祛瘀，祛风除湿，通痹止痛的功效，身痛逐瘀汤治疗LDH具有良好疗效，能有效改善患者疼痛麻木症状，提高生命质量[2]；但对于身痛逐瘀汤治疗LDH的作用机制研究尚不明确。

网络药理学是一门运用网络方法分析药物和疾病靶点之间协同作用关系的药理学分支学科，为研究中药复方复杂药效协同作用机制提供了新策略[3-4]。本研究采用网络药理学方法，挖掘身痛逐瘀汤治疗LDH的潜在有效成分、作用靶点及相关分子作用机制，为后期的深入研究提供方向。

1 资料与方法

1.1 身痛逐瘀汤中药化学活性成分筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[5]，查找身痛逐瘀汤中川芎、当归、红花、没药、牛膝、羌活、秦艽、桃仁、香附9味药的化学成分，因地龙未收录于TCMSP，通过化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)对其进行检索补充；方中甘草为使药，即调和药，主要作用为缓和诸药药性，其用量小，故对其化学成分不作筛选。依据中药的药代动力学ADME即吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)及排泄(Excretion)过程，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，与类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18为筛选条件，选取出中药活性成分。

1.2 身痛逐瘀汤中药活性成分靶点预测 通过以上数据库检索获取各味中药活性成分的CAS编号，利用有机小分子生物活性数据库(pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)对所检索出的CAS编号进行搜索得到活性成分的2D分子结构文件，将2D分子结构文件分别导入SwissTargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)，实现活性成分靶点预测[6]，并筛选“Probability值>0”的结果作为最终预测靶点。

1.3 LDH疾病靶点获取及身痛逐瘀汤治疗LDH潜在作用靶点预测 在人类基因数据库(GeneCards)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、DisGeNET3个疾病靶点数据库输入疾病名称“lumbar disc herniation”进行检索[7]，将筛选结果汇总，去除重复值保留唯一值，即获得疾病LDH靶点集。将疾病LDH靶点集与上述身痛逐瘀汤的中药作用靶点取交集，即得到身痛逐瘀汤治疗LDH的潜在作用靶点。

通过SwissTargetPrediction平台，对筛选出的178个活性成分进行靶点预测，剔除其中无对应靶标的活性成分，对剩余121个活性成分预测并筛选Probability值>0的靶点预测结果。

1.4 中药-活性成分-交集靶点网络构建 将中药、活性成分、交集靶点信息整理至Excel表格，并将其导入Cytoscape软件，构建中药-活性成分-交集靶点网络，对中药、活性成分、交集靶点关系进行可视化分析，探究身痛逐瘀汤治疗LDH活性成分的重要性及相关分子作用机制。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 将身痛逐瘀汤治疗LDH的潜在作用靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，Organism设置为“Homo sapiens”，将置信度得分设置为“high confidence≥0.7”，隐藏孤立于网络之外的节点，进而获取身痛逐瘀汤治疗LDH潜在作用靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，下载保存其TSV格式文件，导入Cytoscape软件，通过Cytoscape软件内置的网络分析插件，对其网络样式进行设置，并绘制PPI网络图，节点(Node)的大小和渐变颜色反映Degree值的大小。

1.6 基因本体富集分析和京都基因和基因组百科全书富集分析 通过上述PPI网络构建分析获得身痛逐瘀汤治疗LDH的关键靶点，将其导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，物种及背景设置为“Homo sapiens”，分别进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，筛选排名靠前的基因功能及通路绘制出直观的柱状图与气泡图。

1.7 细胞实验

1.7.1 实验细胞 人髓核细胞(Sciencell公司，美国，货号：4800)。

1.7.2 药物 所需药材由北京中医药大学东直门医院中药房提供，包括：秦艽3 g、川芎6 g、桃仁9 g、红花9 g、甘草6 g、羌活3 g、没药6 g、当归9 g、香附3 g、牛膝9 g、地龙6 g。根据体表面积法确定给药剂量，选用大耳兔制备中药含药血清，课题前期研究利用噻唑蓝溴化四唑(MTT)比色法筛选出身痛逐瘀汤含药血清最佳的给药浓度为15%，干预时间为24 h。

1.7.3 主要试剂与仪器 高效放射免疫沉淀法(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)组织/细胞裂解液(Thermo公司，美国，货号：89900)；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(Beyotime公司，货号：C1063)；胎牛血清(Sciencell公司，美国，货号：0010)；胰酶/乙二胺四乙酸(Ethylene Diaminetetraacetic Acid，EDTA)(Sciencell公司，美国，货号：0103)；兔核因子κB p65多克隆抗体(Abcam公司，英国，货号：ab16502)；兔基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-13多克隆抗体(Abcam公司，英国，货号：ab39012)；兔胱天蛋白酶-3多克隆抗体(Abcam公司，英国，货号：ab13847)；兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenas，GAPDH)单克隆抗体(Abcam公司，英国，货号：ab181602)。流式细胞仪(Beckmam，美国，型号：Cytomics FC500)；发光凝胶成像系统(SYNGENE，英国，型号：GeneGnome XRQ)；蛋白电泳仪(Bio-rad，美国，型号：PowerPac)；全自动酶标仪(BioTek，美国，型号：Synergy H1)；医用恒温静水压压力罐(柳根哲教授设计，专利号：ZL201520108857.5)。

1.7.4 分组与造模 本研究分为2组，即单纯压力组和经身痛逐瘀汤血清干预的中药组。实验采用10 mL注射器为实验容器，将3代髓核细胞铺片，与培养基共同装入其中，密封注射器的头部保持密闭性；将注射器放置于压力罐中，分别作用2 h、4 h、6 h。将人髓核细胞复苏后，进行传代培养，根据前期课题组研究结果选取第3代髓核细胞进行实验。将髓核细胞放入医用恒温静水压压力罐，设置1 MPa压力进行造模。

1.7.5 细胞凋亡检测 使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide凋亡试剂盒进行双染检测：1)洗涤、胰酶消化贴壁细胞，收集静水压作用后的髓核细胞，以1 000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min，吸去上清。2)加入磷酸盐缓冲溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)0.5 mL重悬细胞；计数选取10万重悬细胞，离心后弃上清。3)195 μL Annexin V-FITC结合液浸润重新重悬细胞，调节浓度。4)加入5 μL Annexin V-FITC混匀，20～25 ℃室温下避光孵育10 min。5)可重复操作重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide，PI)混匀，避光孵育后上机检测。

1.7.6 蛋白质印迹法检测 样本离心后弃上清，润洗2次后加入RIPA裂解液，置于冰上裂解，之后以16 000×g,离心10 min；吸取上清进行含量测定；采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法测定样本浓度后，进行电泳、转膜及显影，将样本加入样孔中，按照浓缩胶80 V/分离胶120 V恒压电泳，将凝胶半干转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭，封闭1 h后清洗3次；加入稀释好的一抗4 ℃孵育过夜。次日洗膜3次，加入二抗孵育，2 h后加入洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween，TBST)清洗，应用显影仪对膜进行显影成像。

2 结果

2.1 身痛逐瘀汤中药化学成分筛选结果 共得到178个符合条件的活性成分，剔除其中无对应靶标的活性成分，最终得到121个活性成分，其中川芎4个、当归2个、地龙17个、红花19个、没药20个、牛膝14个、羌活10个、秦艽2个、桃仁18个、香附15个。

2.2 身痛逐瘀汤作用靶点预测及其治疗LDH潜在作用靶点的预测 共获得871个身痛逐瘀汤活性成分作用靶点，获得438个LDH疾病相关靶点。身痛逐瘀汤治疗LDH的交集靶点75个。见图1。

图1 身痛逐瘀汤与LDH疾病靶点匹配韦恩图

2.3 中药-活性成分-交集靶点网络构建与分析 中药-活性成分-交集靶点网络由175个节点、921条边组成，以Degree值大小进行排序，其中β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黄芩素(Baicalein)排名靠前，说明其在身痛逐瘀汤治疗LDH过程中发挥重要作用。见图2。

图2 中药-活性成分-交集靶点网络

2.4 身痛逐瘀汤治疗LDH关键作用靶点的PPI网络构建 获取满足筛选条件的关键作用靶点69个。PPI网络中有69个节点，447条边，节点平均Degree值为13.0，其中STAT3、IL6、VEGFA、MAPK1、TP53、MMP9、AKT1、JUN、TNF、HRAS、MMP13等排列靠前。见图3。

图3 身痛逐瘀汤治疗LDH关键作用靶点的PPI网络

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析结果 GO分析中得到生物过程(Biological Process，BP)相关条目366条，其中包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、细胞增殖的正调控(Positive Regulation of Cell Proliferation)、信号转导(Signal Transduction)、凋亡过程的负调控(Negative Regulation of Apoptotic Process)等；分子功能(Molecular Function，MF)相关条目66条，其中涉及蛋白质结合(Protein Binding)、ATP结合(ATP Binding)、同种蛋白质结合(Identical Protein Binding)、锌离子结合(Zinc Ion Binding)、丝氨酸型内肽酶活性(Serine-type Endopeptidase Activity)等分子功能；细胞组分(Cell Component，CC)相关条目43条，包括质膜、细胞质、细胞核、细胞质溶胶、胞外区等。见图4。

图4 GO富集分析BP、CC、MF结果

KEGG信号通路富集结果显示，身痛逐瘀汤治疗LDH涉及的信号通路150余条，筛选身痛逐瘀汤治疗LDH关键作用靶点的主要相关信号通路，包括：癌症通路、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B，PI3K/AKT)信号通路、核因子κB信号通路、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)信号通路、叉头框O(Forkhead Box O，FoxO)信号通路等。见图5。

图5 KEGG通路富集分析结果

2.6 细胞凋亡检测 随着静水压作用时间的增加，2组细胞的凋亡率增高；与单纯压力组比较，中药组凋亡率明显有所下降(P<0.05)。见图6。

图6 髓核细胞凋亡情况

2.7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表达情况 在1 MPa压力作用下，单纯压力组核因子κB p65蛋白水平在4 h时明显增加，之后蛋白表达量明显下降，而MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表达水平随时间增加而上升。在同一作用时间下，中药组核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表达水平明显低于单纯压力组(P<0.05)。经身痛逐瘀汤含药血清干预后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表达受到抑制。见图7。

图7 核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白表达情况

3 讨论

身痛逐瘀汤源自《医林改错》，是古代经典名方之一，易腾达等[8]学者在原方基础上剔除五灵脂(因该药自1990年后未收入《中华人民共和国药典》)，建议身痛逐瘀汤临床组方如下：秦艽、川芎、桃仁、红花、甘草、羌活、没药、当归、香附、牛膝、地龙；身痛逐瘀汤全方共奏活血祛瘀、祛风除湿、通痹止痛之功。该方在骨科领域运用广泛，对治疗LDH具有良好疗效。LDH的发病与椎间盘退变密切相关，有研究表明力学载荷、细胞凋亡和炎症介质等是促使椎间盘退变的主要危险因素[9]。现代相关研究发现，该方药理作用广泛，不仅具有抗炎镇痛作用，还有营养保护神经，降低骨骼肌微损伤，延缓椎间盘退变等作用，身痛逐瘀汤可能通过多种作用途径治疗LDH[10-11]。

本网络药理学研究中，根据中药-活性成分-交集靶点网络分析结果显示，β-谷固醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、木犀草素(Luteolin)、黄芩素(Baicalein)度值较高，说明其在治疗LDH过程中可能发挥重要作用。在对身痛逐瘀汤药物活性成分的筛选中，可以发现上述活性成分广泛分布于身痛逐瘀汤的多味药物中，其中β-谷固醇存在于当归、红花、没药、羌活、秦艽、香附、牛膝、桃仁中，研究显示，β-谷固醇具有的抗炎作用明确，其可通过调节吞噬细胞功能来抑制促炎症介质的产生进而改善类风湿炎症[12]；通过抑制核因子κB的活化来减轻右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎[13]；通过抑制p38、胞外信号调节激酶和核因子κB通路，降低白细胞介素6(Interleukin，IL-6)、TNF-α等相关炎症介质来影响小胶质细胞活性、抑制神经炎症从而延缓神经退变[14]。相关研究表明炎症反应已被认为是LDH椎间盘退变的主要因素，巨噬细胞是椎间盘突出吸收过程中的重要免疫参与者，β-谷固醇可通过调节细胞功能及抑制相关炎症信号通路对关节炎、结肠炎及神经炎症等发挥良好的抗炎作用[15-16]，其在治疗LDH椎间盘退变过程中也可能发挥重要作用，目前尚未报道β-谷固醇是否对椎间盘退变相关炎症介质发挥抗炎作用，这为日后的研究提供新方向。

槲皮素存在于红花、没药、牛膝、香附中，其可抑制IL-1β诱导的核因子κB途径级联反应的激活，通过核因子E2相关因子2/核因子κB轴改善椎间盘退变[17]。山柰酚、黄芩素存在于红花、牛膝中，其中山柰酚不仅能调控脂质代谢相关基因，减缓细胞凋亡、增强细胞活力，还能减少促炎症介质IL-6、增加抗炎细胞因子IL-10的水平发挥其抗炎作用从而延缓LDH椎间盘退变[18]。黄芩素可抑制核因子κB和MAPK信号通路的激活，其主要通过以下方面延缓椎间盘退变：一是通过抑制相关炎症介质的表达来参与炎症反应[19]，二是通过参与力学载荷，抑制压力诱导的髓核细胞的凋亡，延缓椎间盘退变的进程[20]。山柰酚和黄芩素作为LDH椎间盘退变的潜在治疗剂具有巨大研究价值。

PPI网络中，分析69个关键靶点蛋白的相互作用关系，其中信号转导及转录激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3是STAT成员之一，在腰椎间盘髓核突出引起的持续疼痛大鼠模型的实验研究中，发现STAT3通过上调脊髓趋化因子C-X-C基序配体12的表达介导腰椎间盘髓核突出引起的机械痛敏，抑制STAT3的活化显著缓解腰椎间盘突出诱导的持续疼痛[21]；IL-6是一种炎症介质，在椎间盘髓核中检测细胞质中表达的IL-6，腰椎间盘突出组IL-6表达显著升高。IL-6基因过表达是椎间盘退变的重要危险因素[22]，IL-6水平增高可引起LDH持续性腰椎神经根痛症状[23]，研究表明通过IL6/STAT3通路可调节腰椎间盘退变的发生[24]。调节血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)A的表达可改善椎间盘的营养供应进而延缓椎间盘退变[25]，肿瘤蛋白P53也称P53，属于人体抑癌基因的一种，VEGF与P53可在椎间盘组织中协同表达，共同参与血管形成和浸润，并加速椎间盘组织变性[26]。MAPK1又叫胞外信号调节激酶2，通过参与MAPK信号转导通路控制髓核细胞凋亡，为椎间盘退变过程中的重要基因[27]。MMP9、MMP13是基质金属蛋白酶家族成员，研究发现，MMP9在miR-133a的下调靶向作用下可诱导Ⅱ型胶原蛋白丢失，进而影响椎间盘退变[28]。Jun为活化蛋白-1转录因子家族的成员，实验研究发现c-Jun通过上调转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)的表达促进细胞增殖并减少细胞凋亡，通过降低TNF-α，IL-1β，IL-6的表达来抑制炎症反应，进而延缓椎间盘退变[29]。TNF基因家族中，TNF-α属于其中一员，其通过核因子κB信号转导通路在腰椎间盘突出的病理生理过程中发挥重要作用[30]。通过GO富集分析可推测，这些关键靶点蛋白主要在质膜、细胞核、细胞质等位置发挥作用，并通过细胞增殖的正调控、凋亡的负调控、信号转导等生物过程，发挥激酶活性、与蛋白质结合等分子功能。

KEGG信号通路富集分析中，MAPK、PI3K-AKT、TNF以及核因子κB信号通路可能为身痛逐瘀汤治疗LDH的关键信号通路。其中，MAPK信号通路主要存在胞外信号调节激酶、JUK及p38MAPK 3种经典信号通路，与炎症反应、细胞凋亡及细胞生长分化密切相关，综合MAPK信号通路相关研究报道，其可能通过以下几个方面来延缓LDH的椎间盘退变：1)抑制炎症反应：有研究表明内质网应激与椎间盘退变的微环境相关[31]，其可通过p38 MAPK信号通路转导介导IL-6的释放，降低椎间盘退变微环境的恶化，进而延缓椎间盘退变；Ge等[32]研究发现外源性IL-10治疗可诱导抗炎反应并抑制p38 MAPK活化，可减轻髓核细胞的形态和细胞外基质变性，从而延迟椎间盘变性。2)介导细胞外基质的合成、分解代谢：细胞外基质的合成分解代谢失衡是软骨细胞和椎间盘髓核细胞变性的关键影响因素，有研究发现白血病抑制因子能促进聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1的表达，其可通过激活MAPK-ERK1/2信号通路促进髓核细胞外基质的合成，起到延缓椎间盘退变的作用[33-34]。3)诱导细胞增殖、凋亡、自噬作用：据报道机械负荷与糖尿病是椎间盘退变的危险因素，机械生长因子可降低胱天蛋白酶3活性，下调Bax基因/蛋白表达，而增高机械性超负荷条件下Bcl-2基因/蛋白质表达，其通过调节p38 MAPK通路来减轻机械性超负荷诱导的髓核细胞的凋亡[35]；Shan等[36]通过高糖对大鼠椎间盘纤维环(Annulus Fibrosus，AF)细胞凋亡实验研究发现，高葡萄糖通过以葡萄糖浓度依赖性方式调节JNK信号通路和p38 MAPK信号通路来促进椎间盘纤维环细胞凋亡；也有研究发现，下调的胰岛素样生长因子结合蛋白3可以通过靶向胞外信号调节激酶/MAPK信号通路来抑制髓核细胞的迁移和侵袭[37]，该过程与细胞增殖、凋亡、自噬和细胞衰老密切相关。PI3K/AKT信号通路在身痛逐瘀汤治疗LDH过程中也可能发挥重要作用，有研究表明通过调控PI3K/AKT信号通路，可减少髓核细胞外基质的降解，促进增殖并降低细胞凋亡和炎症水平，从而缓解椎间盘退变，其作用机制与MAPK信号通路具有相通之处[38-40]。在对LDH椎间盘退变的研究中，核因子κB对椎间盘退变的作用机制包括调节细胞外基质的代谢平衡、介导炎症反应及诱导细胞凋亡[41]。有研究报道机械应力刺激通过激活核因子κB信号通路直接诱导基质降解酶，从而加速髓核细胞外基质的分解代谢水平，促进髓核细胞变性[42-43]；Gao等[44]发现柚皮苷通过下调核因子κB通路和p53表达来减轻炎症反应及减弱基质金属蛋白酶分解代谢，从而降低髓核细胞凋亡。

本研究中，在加压环境下，随着时间的增加，单纯压力组髓核细胞凋亡率随着作用时间也不断增高；相对于单纯压力组，在同一作用时间下，经身痛逐瘀汤中药血清干预后的中药组髓核细胞凋亡率更低，说明身痛逐瘀汤中药血清可降低髓核细胞凋亡率。蛋白质印迹法检测蛋白显示，在同一作用时间下，中药组核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3的蛋白表达水平明显低于单纯压力组，说明经身痛逐瘀汤含药血清干预后核因子κB p65、MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表达受到抑制，身痛逐瘀汤可能通过抑制核因子κB信号通路，抑制MMP-13、胱天蛋白酶3蛋白的表达来减少髓核细胞的凋亡，进而延缓椎间盘退变。

综上所述，LDH发病机制错综复杂，身痛逐瘀汤通过多种活性成分作用于多个相关基因靶点，并通过多种信号通路来治疗LDH，这体现了身痛逐瘀汤治疗LDH具有多成分、多靶点、多通路的特点，其可能通过抑制炎症反应、介导细胞外基质合成分解代谢及诱导细胞增殖、凋亡、自噬作用等作用通路来发挥治疗LDH的作用，这为身痛逐瘀汤治疗LDH的基础和临床研究提供新的方向。网络药理学方法对中药复方作用机制的研究存在本身的局限性[45]，不能全面地分析身痛逐瘀汤所有成分、作用靶点及通路，今后还需要更深入地挖掘及通过相关实验进行验证。