小儿支气管哮喘发作期血清miR-146a、miR-21及miR-126水平与哮喘严重程度的相关性*

邓颖云， 黄淑芹， 邱成英

(三亚市人民医院 儿科， 海南 三亚 572000)

支气管哮喘主要以气道炎症、气道重塑及气道反应增高为特点，其病因主要有环境影响及先天遗传等。有研究报道，儿童支气管哮喘发病率正逐年增高[1-2]。微小RNA(miRNA)是一组18～24个核苷酸的非编码RNA，可调控细胞的凋亡、代谢及生长[3-4]。研究发现，微小RNA-146a(miR-146a)、微小RNA-21(miR-21)、微小RNA-126(miR-126)参与了多种疾病的发生与发展，例如miR-146a其基因型与类风湿关节炎的特定临床表现有关，在类风湿关节炎发病中具有一定的作用[5]；miR-21与糖尿病视网膜病变的发生发展密切相关，可作为糖尿病视网膜病变诊断的生物学标志物[6]；而高表达的miR-126则可促进细胞凋亡、阻滞乳腺癌细胞的周期进程，发挥抗肿瘤作用[7]。目前关于血清miR-146a、miR-21及miR-126表达与小儿支气管哮喘关系的研究报道较少，本研究通过观察miR-146a、miR-21及miR-126水平在小儿支气管哮喘发作时的变化，探讨其在小儿支气管哮喘发作时的意义，为临床评估小儿支气管哮喘的病情提供思路，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料及材料

1.1.1一般资料 选取2019年1月—2022年1月儿科收治的130例哮喘发作期患儿作为观察组，纳入标准：符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[8]中关于哮喘的诊断标准、且处于发作期，年龄<15岁。排除标准：(1)哮喘缓解期患儿;(2)伴心脏病、呼吸衰竭的患儿;(3)伴有血液系统疾病;(4)合并呼吸道传染疾病;(5)精神失常患儿。根据《支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案)》[8]，将观察组患儿再分为轻度组(n=41)、中度组(n=56)及重度组(n=33)。本研究经医院医学伦理委员会审核批准(伦理号KYLL-2018-11)、且家属均签署知情同意书。选取同期130例体检正常的儿童作为对照组。

1.1.2主要试剂和仪器 miR-146a、miR-21、miR-126、U6引物均由美国英杰公司设计合成，TRIzol试剂购于美国英杰公司，PrimeScript RT试剂盒购于中国TaKaRa公司，Rotorgene 3000系列PCR仪购于澳大利亚悉尼科比特研究中心。

1.2 研究方法

1.2.1样本收集 所有儿童均于清晨抽取空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心5 min分离血清，置于-80 ℃保存待检。

1.2.2血清miR-146a、miR-21、miR-126水平检测 在血清中加入TRIzol试剂提取总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA。应用绿色PCR系统在Rotorgene3000系列PCR仪上进行反应[7]，最后由Rotorgene软件进行miRNA和mRNA定量分析，U6为标准内参照，使用2-ΔΔCt方法计算miR-146a、miR-21、miR-126的相对表达水平。miR-146a上游引物序列为5′-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3′、下游引物序列为5′-CCTCGAGTATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3′，miR-21上游引物序列为5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′、下游引物序列为5′-AUCGAAUAGUGUGACUACAACU-3′，miR-126上游引物序列为5′-AGACCACAGTTTGGCAATTGG-3′、下游引物序列为5′-AGGAGAATCCTGGCACATCG-3′，U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′、下游引物序列为5′-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料

观察组患儿男73例、女57例，年龄4～14岁、平均(9.25±4.58)岁；对照组儿童男70例、女60例，年龄4～14岁，平均(9.68±4.29)岁。2组儿童性别、年龄等基础资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2 血清miR-146a、miR-21、miR-126表达

结果显示，观察组患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平明显高于对照组儿童，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表1。观察组不同程度哮喘患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126相对表达水平比较，轻度组<中度组<重度组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 血清miR-146a、miR-21、miR-126相对表达水平与患儿哮喘严重程度的相关性

分析结果显示，观察组患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与哮喘严重程度呈正相关(P<0.05)。见表3。

表1 观察组与对照组儿童血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平Tab.1 Comparison of serum miR-146a, miR-21, and miR-126 expression levels between

表2 观察组不同程度哮喘患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平Tab.2 Comparison of serum expression levels of miR-146a, miR-21, and miR-126 in children with different severity asthma in

表3 观察组患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与哮喘严重程度相关性Tab.3 Correlation between serum miR-146a, miR-21, miR-126 levels and severity of illness in observation group

2.4 血清miR-146a、miR-21、miR-126相对表达水平在小儿支气管哮喘中的诊断效能

ROC分析结果显示，血清miR-146a、miR-21、miR-126相对表达水平检测均可用于小儿支气管哮喘的预测，AUC为0.738、0.767、0.869(P<0.05)。见图1和表4。

图1 血清miR-146a、miR-21、miR-126指标预测小儿支气管哮喘的ROC曲线Fig.1 ROC curve of indicators for predicting bronchial asthma in children

表4 miR-146a、miR-21、miR-126在小儿支气管哮喘中的诊断效能Tab.4 Diagnostic efficacy of miR-146a, miR-21, and miR-126 in pediatric bronchial asthma

3 讨论

支气管哮喘是一种常见的呼吸系统慢性疾病，常见症状表现为喘息、胸闷和呼吸困难等，可发作于各个年龄段，儿童期是哮喘的高发时段[10]。支气管哮喘在环境污染、天气等众多因素的影响下，致使疾病的发生率越来越高[11]。支气管哮喘是一种慢性疾病，需长期服用药物控制病情，小儿患者治疗依从性差，严重时可导致气道不可逆性狭窄和气道重建，因此，早诊断、及时有效的治疗对患儿病情恢复具有较大的帮助[12]。miRNA是非小编码RNA，临床研究已证实miRNA与支气管哮喘的发生密切相关[13]。既往研究发现，miR-146a在多种疾病中表达异常，且能间接调控炎性因子水平，并参与炎症反应[14]。miR-21在支气管哮喘患者中高表达，且能够抑制炎症反应，改善气道炎症[15]。miR-126在支气管哮喘中表达异常，能通过优势转化提高炎性因子水平，加重患者炎症反应，促进支气管哮喘的病情发展[16]。本次研究结果显示，观察组患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126相对表达水平明显高于对照组儿童。提示血清miR-146a、miR-21、miR-126可能与支气管哮喘发生有关。

qRT-PCR方法是一种有效、准确的miRNA检测方法，本研究为探讨miR-146a、miR-21、miR-126水平与哮喘的发病机制关系，采用qRT-PCR实验对观察组和对照组儿童血清miR-146a、miR-21、miR-126表达进行检测，结果发现miR-146a、miR-21、miR-126在观察组患儿中的表达均高于对照组(P<0.001)，且不同病情程度患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平轻度组<中度组<重度组(P<0.05)。提示miR-146a、miR-21、miR-126与支气管哮喘的发生的确有关系，且还可提示疾病严重程度，但具体的作用机制尚不明确，可能与DNA损伤、细胞周期调节或免疫应答等有关[17-18]。

为进一步研究血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与支气管哮喘患儿的关系，本次研究分析了血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与支气管哮喘严重程度的相关性，结果显示，观察组患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与病情程度呈正相关(P<0.05)，提示血清miR-146a、miR-21、miR-126表达水平与患儿病情程度有关，miR-146a、miR-21、miR-126表达水平越高病情越重。有研究表明，与正常儿童比较，哮喘患儿的miR-146a水平明显升高，表明miR-146a与哮喘的发病相关[19]。还有研究表明，miR-21表达与病情严重程度和炎性因子活化程度有关，且对早期诊断支气管哮喘具有一定价值。另外，miR-126在哮喘炎症反应中有一定的调节作用，进而抑制miR-126的表达，抑制细胞释放出炎症细胞因子，减少气道黏液的分泌量，进而缓解哮喘的急性发作[20-21]。在国外动物模型实验中，卵清蛋白诱导小鼠构建哮喘模型后，小鼠呼吸道组织中miR-126水平明显升高，且炎症水平等也出现升高现象，在小鼠症状缓解后，miR-126水平随之下降[22]。这一结果与本次研究结果相似。本研究经ROC分析证实miR-146a、miR-21、miR-126均可用于小儿支气管哮喘的预测，AUC为0.738、0.767、0.869(P<0.05)。提示miR-146a、miR-21、miR-126对早期诊断支气管哮喘具有一定的价值。

综上所述，本研究发现小儿支气管哮喘发作期患儿血清miR-146a、miR-21、miR-126高表达，表达水平与病情程度呈正相关，均可用于小儿支气管哮喘的预测。但本次研究样本量较少，且只针对哮喘发作期患儿进行研究，缺乏对持续期、缓解期患儿的研究结果，还需多方面进行研究，以提高研究的准确性。