补肾健脾方对db/db小鼠糖代谢及骨代谢的影响

刘峰，罗冬强，王珍

（1.广东祈福医院，广东 广州 511495；2.广州中医药大学，广东 广州 510405）

糖尿病是以血糖升高为主要表现的代谢性疾病。大量研究发现，糖尿病患者同时存在骨代谢紊乱，易合并骨质疏松。流行病学调查显示，高达21.1%的糖尿病人群伴发骨质疏松性骨折[1]，糖尿病患者的骨折风险明显超过非糖尿病人群[2]。目前，骨质疏松及骨折已被视为老年糖尿病患者的一个重要并发症，即使在年轻的2型糖尿病患者人群中，骨质疏松性骨折也不少见[3]。补肾健脾方是本科协定方，该方具有降低2型糖尿病患者血糖、糖化血红蛋白[4]，改善患者胰岛功能[5]，增加2型糖尿病患者骨密度[6]等临床疗效。因此，本研究旨在观察补肾健脾方对db/db小鼠糖代谢及骨代谢指标的影响，探讨该方降糖及增加骨密度可能的作用机制，以期为该方在2型糖尿病合并骨质疏松治疗中的应用提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物4周龄雄性db/db阳性小鼠16只，BKS背景阴性小鼠8只，体质量约20 g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。动物实验通过广东祈福医院伦理委员会批准。

1.2 药物、试剂与仪器补肾健脾方由淫羊藿12 g、鹿角胶15 g、黄精12 g、沙苑子15 g、制首乌15 g、黄芪30 g、山药30 g、葛根30 g、丹参30 g、制大黄10 g组成。以上中药饮片均购自广东祈福医院中药房，加工成冻干粉。小鼠脂联素（APN）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、小鼠胰岛素ELISA试剂盒、小鼠25-羟基维生素D3[25-（OH）D3]ELISA试剂盒、小鼠Ⅰ型前胶原氨基端原肽（PINP）ELISA试剂盒（武汉基因美科技有限公司）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Bax抗体、Bcl-2抗体、Caspase-3抗体、山羊抗兔IgG（北京中杉金桥公司）。酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；RM2016切片机（上海徕卡仪器有限公司）；DM500光学显微镜（德国Leica公司）。

1.3 分组与给药将16只雄性db/db阳性小鼠随机分为治疗组和阳性对照组，每组8只；8只BKS背景阴性小鼠作为阴性对照随机分为阴性对照组1和阴性对照组2，每组4只。适应性饲养1周，治疗组和阴性对照组1给予补肾健脾方冻干粉溶液9.95 g/kg灌胃，每日2次；阳性对照组和阴性对照组2给予等体积生理盐水灌胃，每日2次。连续给药4周。

小鼠灌胃剂量计算方法：中药按20%出粉率计算，补肾健脾方冻干粉人体用量为0.796 g·kg-1·d-1，按小鼠用药量为人体用药量25倍计算小鼠用药量为19.9 g·kg-1·d-1。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 血液指标检测灌胃4周后，断颈处死小鼠，腹主动脉取血，检测小鼠血清血糖指标，按试剂盒说明书采用ELISA法检测血清胰岛素、APN、25-（OH）D3及PINP水平。

1.4.2 苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠胰岛病理学变化将4%多聚甲醛固定的胰腺组织进行常规石蜡包埋，切片，HE染色，并在光学显微镜下观察胰岛病理学改变。

1.4.3 TUNEL法观察小鼠胰岛细胞凋亡情况具体操作步骤按TUNEL试剂盒说明书进行。依次将胰腺组织石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min-蒸馏水洗。滴加蛋白酶K工作液，37℃温箱孵育20 min，PBS洗涤3次。加破膜工作液，常温孵育20 min，PBS洗涤3次。放入3%双氧水溶液中室温避光孵育20 min，PBS洗涤3次。滴加buffer常温孵育10 min，去掉平衡液。Recombinant TdT Enzyme∶Biotin-dUTP Labeling Mix∶Equilibration Buffer=1 μL∶5 μL∶50 μL比例混合加入，湿盒内37℃温箱孵育1 h，PBS洗涤3次。Streptavidin-HRP和TBST按 照1∶200比 例 混 合 加入，湿盒内37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤3次。滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，纯水冲洗切片终止显色。苏木素复染1 min，纯水洗涤，分化液分化数秒，纯水洗涤，氨水返蓝，纯水冲洗。无水乙醇脱水，随后正丁醇浸泡5 min，放入二甲苯中进行透明后晾干，中性树胶封片。苏木素染细胞核呈蓝色，DAB显现出来的阳性凋亡细胞核呈棕黄色。

1.4.4 免疫组织化学法观察小鼠胰腺凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性表达情况取胰腺组织石蜡切片，脱蜡和水化，抗原修复，消除内源性过氧化物酶活性，封闭。一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3 37℃孵育60~120 min，二抗37℃孵育0.5~2 h，DAB显色。苏木素复染、脱水、透明和封片，拍照。用ImageJ软件分析Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性面积百分比。Bax、Bcl-2在细胞浆表达，Caspase-3在细胞浆和细胞核均有表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒。

1.5 统计方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差不齐，则采用Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清空腹血糖及空腹胰岛素水平比较表1结果显示，经过补肾健脾方干预后，治疗组小鼠空腹血糖值和胰岛素水平均低于阳性对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组小鼠血清空腹血糖及空腹胰岛素水平比较Table 1 Comparison of mouse serum fasting blood glucose and fasting insulin levels among various groups （±s）

表1 各组小鼠血清空腹血糖及空腹胰岛素水平比较Table 1 Comparison of mouse serum fasting blood glucose and fasting insulin levels among various groups （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与阴性对照组1比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与阴性对照组2比较；⑤P＜0.01，与阳性对照组比较

组别阴性对照组1阴性对照组2阳性对照组治疗组鼠数/只4 4 8 8空腹血糖/（mmol·L-1）6.90±0.66 7.90±0.51 11.73±1.40②④9.00±1.14②⑤空腹胰岛素/（mU·L-1）5.02±0.23 5.13±0.77 8.12±0.97②④6.35±0.97①③⑤

2.2 各组小鼠血清APN、25-（OH）D3、PINP水平比较表2结果显示：经补肾健脾方干预后，治疗组小鼠APN、25-（OH）D3、PINP水平较阳性对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗组25-（OH）D3水平较阴性对照组2明显升高（P＜0.05），阴性对照组2的APN水平较阴性对照组1明显降低（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血清脂联素（APN）、25-羟基维生素D3[25-（OH）D3]、Ⅰ型前胶原氨基端原肽（PINP）水平比较Table 2 Comparison of mouse serum adiponectin（APN），25-hydroxyvitamin D3[25-（OH）D3]and precollagen type I aminoterminal propeptide（PINP）levels among various groups （±s）

表2 各组小鼠血清脂联素（APN）、25-羟基维生素D3[25-（OH）D3]、Ⅰ型前胶原氨基端原肽（PINP）水平比较Table 2 Comparison of mouse serum adiponectin（APN），25-hydroxyvitamin D3[25-（OH）D3]and precollagen type I aminoterminal propeptide（PINP）levels among various groups （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与阴性对照组1比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与阴性对照组2比较；⑤P＜0.01，与阳性对照组比较

组别阴性对照组1阴性对照组2阳性对照组治疗组鼠数/只4 4 8 8 APN/（pg·mL-1）116.93±5.94 93.71±4.53①100.86±10.23 123.63±18.02②⑤25-（OH）D3/（ng·mL-1）8.25±1.95 6.78±0.44 6.55±1.65 9.43±0.90③⑤PINP/（μg·mL-1）365.69±49.08 329.26±36.20 249.65±18.51②④306.33±19.92②⑤

2.3 各组小鼠胰岛病理形态比较图1结果显示：阴性对照组小鼠胰岛细胞结构清晰，数量较多；阳性对照组小鼠胰岛细胞结构受到明显破坏，数量明显减少；经补肾健脾方干预后，治疗组小鼠胰岛细胞无论是结构还是数量，与阳性对照组相比较，均得到明显改善。

图1 各组小鼠胰岛病理形态比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the histopathological morphology of the mouse pancreas isletamong various groups（by HE staining，×100）

2.4 各组小鼠胰岛细胞凋亡比较图2结果显示：阴性对照组小鼠胰岛细胞未见明显变化，阳性对照组小鼠胰岛细胞凋亡明显，治疗组小鼠胰岛细胞虽然可见细胞凋亡，但与阳性对照组相比较，其凋亡细胞明显减少。表3结果显示：与阳性对照组比较，治疗组小鼠胰腺TUNEL染色面积百分比降低（P＜0.01）。表明补肾健脾方可抑制胰岛细胞凋亡。

表3 各组小鼠胰岛TUNEL染色面积百分比比较Table 3 Comparison of the percentage of TUNELstained area of mouse pancreas islets among various groups（±s）

表3 各组小鼠胰岛TUNEL染色面积百分比比较Table 3 Comparison of the percentage of TUNELstained area of mouse pancreas islets among various groups（±s）

①P＜0.01，与阳性对照组比较

组别阴性对照组1阴性对照组2阳性对照组治疗组鼠数/只4 4 8 8 TUNEL染色阳性面积/%8.32±1.02 6.81±2.73 17.15±5.54 7.68±3.75①

图2 各组小鼠胰岛TUNEL染色结果（×100）Figure 2 TUNEL staining results of the pancreasislets of various groups of mice（×100）

2.5 各组小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性面积百分比比较表4、图3~图5结果显示：与阳性对照组，治疗组db/db小鼠胰腺Bax、Caspase-3阳性面积百分比降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2阳性面积百分比升高（P＜0.01）。表明补肾健脾方可增强凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，保护胰岛细胞。

图5 各组小鼠胰腺Bcl-2免疫组织化学结果（×100）Figure 5 Immunohistochemical results of Bcl-2 in the pancreas of various groups of mice（×100）

表4 各组小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性面积百分比比较Table 4 Comparison of the percentage of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 positive area in mouse pancreas among various groups（±s）

表4 各组小鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性面积百分比比较Table 4 Comparison of the percentage of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 positive area in mouse pancreas among various groups（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与阳性对照组比较

组别阴性对照组1阴性对照组2阳性对照组治疗组鼠数/只4 4 8 8 Bax/%46.34±3.83 45.24±2.75 51.42±4.07 40.21±3.96②Bcl-2/%53.75±3.97 56.88±5.98 42.73±4.84 58.89±9.62②Caspase-3/%44.04±10.86 40.39±3.59 52.13±6.03 40.70±4.59①

图3 各组小鼠胰腺Caspase-3免疫组织化学结果Figure 3 Immunohistochemical results of Caspase-3 in the pancreas of various groups of mice（×100）

图4 各组小鼠胰腺Bax免疫组织化学结果（×100）Figure 4 Immunohistochemical results of Bax in the pancreas of various groups of mice（×100）

3 讨论

2型糖尿病合并骨质疏松归属于中医学“消渴骨痿”的范畴[7]，脾肾二脏是该病的主要病位。《黄帝内经·素问篇》指出“肾生骨髓”“肾主骨”，即骨骼的生长发育与肾密切相关。一方面，糖尿病患者脾气亏虚，运化水谷功能出现障碍，影响水谷精微的消化，致使吸收不足[8]；另一方面，肾藏精，精生髓，髓生骨，水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不能任身，发为骨痿[9]。因此，从发病机制上，“消渴骨痿”是“消渴”的进一步发展，可视为消渴病变之一。因此，其治法仍可遵循课题组前期应用补肾健脾法治疗糖尿病的原则，使用补肾健脾方来进行治疗。

胰岛细胞功能决定胰岛素的分泌水平，胰岛素除了能够降低血糖，还与骨代谢相关。研究[10]表明：成骨细胞表面存在胰岛素受体，胰岛素通过这些受体，发挥促进骨形成的作用；胰岛素受体也存在于破骨细胞表面，胰岛素与破骨细胞表面胰岛素受体结合，抑制破骨细胞活性，从而抑制骨吸收。可见，胰岛细胞功能与糖-骨代谢关系密切。本研究中，HE染色结果显示，阳性对照组小鼠胰岛细胞结构受到破坏，TUNEL染色结果也可见阳性对照组小鼠胰岛细胞更容易被染色，表明补肾健脾方对小鼠胰岛细胞具有保护作用。Bax具有促凋亡作用，本研究发现，Bax表达在阳性对照组显著增强，在治疗组受到明显抑制且水平与阴性对照组非糖尿病小鼠相当；Bcl-2有抑制凋亡作用，其表达在阳性对照组小鼠胰岛细胞被明显抑制，在治疗组中显著增强；Caspase-3的表达在阳性对照组增强，在治疗组中明显受到抑制。以上凋亡相关蛋白表达结果提示补肾健脾方对db/db小鼠胰岛细胞凋亡有抑制作用，胰岛细胞凋亡程度直接决定小鼠胰岛素分泌水平，而胰岛素又在糖代谢及骨代谢过程中均发挥作用，并能够影响其代谢指标。

脂联素（APN）由脂肪细胞分泌，可增强胰岛素敏感性[11]，同时对骨骼肌代谢具有保护作用[12]。APN通过影响成骨细胞和破骨细胞活性调节骨代谢[13-15]。Oshima等[16]发现，APN可以抑制破骨细胞的分化，亦可促进成骨细胞的增殖与活性，促进骨生成，增加骨密度。可见，APN对于糖代谢及骨代谢均有调节作用。Ⅰ型前胶原氨基端原肽（PINP）由成骨细胞分泌，其升高提示I型胶原的合成速率加快，骨形成活跃[17]。25-羟基维生素D3[25-（OH）D3]缺乏是导致骨质疏松症发生的重要原因，维持充足的25-（OH）D3是骨骼健康的必要条件[18]。APN、25-（OH）D3、PINP均是反映骨代谢变化的指标，其中APN又与糖代谢密切相关。本研究还发现，对于db/db阳性小鼠和BKS背景阴性小鼠，给予补肾健脾方干预后，其血清APN水平均高于生理盐水灌胃组，提示无论小鼠血糖水平如何，补肾健脾方均能升高其血清APN水平。阳性对照组和治疗组2组db/db小鼠PINP水平均低于阴性对照组，提示高糖环境下，PINP水平受抑制，给予补肾健脾方灌胃后，治疗组小鼠PINP水平显著高于阳性对照组，表明补肾健脾方能够调节db/db小鼠PINP水平。在本研究中，治疗组25-（OH）D3水平能维持较高水平，且显著高于阳性对照组，提示补肾健脾方可以直接调节糖-骨代谢相关指标。

综上所述，补肾健脾方可改善db/db小鼠糖代谢及骨代谢指标，其可能的机制有两点：一是通过抑制胰岛细胞凋亡、改善胰岛素分泌水平实现的；二是直接调节糖-骨代谢指标。补肾健脾方对以上指标的影响，可能是其在临床上降低患者血糖，提高患者骨密度的作用机制之一。