基于Ngn3和Caspase-3探讨姜黄素对宫内发育迟缓仔鼠胰腺发育及糖脂代谢的影响

刘晓玲，雷小平，张莲玉

（西南医科大学附属医院新生儿科，四川 泸州 646000）

宫内发育迟缓（intrauterine growth restriction，IUGR）是指胎儿出生体质量降低平均体质量2个标准差，是围产期的主要并发症，是导致围产儿死亡的主要原因，IUGR患儿伴随体能及智力发育异常[1]。寻找适宜的治疗方法积极改善IUGR具有重要的研究意义。IUGR病因复杂多样，胎盘功能紊乱、微循环障碍是IUGR的主要病理[1-2]。基于中医活血化瘀与现代医学疏通微循环相通的原理[3]，本研究选择活血化瘀中药姜黄来源的单体为研究对象。姜黄素（curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄（curcuma longaL.）根茎中提取的一种酚性色素，是有效的药物单体，具有抗氧化、抗炎、抗凝、降血脂、降血糖、抗肿瘤、保肝及增加免疫功能等作用，且毒性低[4-5]。本研究通过构建IUGR大鼠模型，观察姜黄素对其治疗作用及机制，以期为临床治疗IUGR药物的选择提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级无交配史8~10周龄SD大鼠，雄性10只，雌性20只，体质量240~270 g，均购自广东省医学实验动物中心，动物质量合格证号：2019A008，生产许可证号：SCXK（粤）2019-0010。动物饲养管理均在本院动物实验房内进行，动物实验的实施严格遵照《实验动物护理和使用指南》。

1.2 药物、试剂与仪器姜黄素（分子量：368.385；分子式：C21H20O6同分异构体），购自美国Sigma公司，批号：C1386。总胆固醇（TC）、胆固醇（CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海莼试生物）；免疫组织化学EliVisionTM试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司）；兔抗鼠Ngn3单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体（美国CST公司）；兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体（碧云天生物技术研究所）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]。蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；荧光显微镜（北京测维光电仪器厂）。

1.3 建模方法按照雌雄2∶1合笼，交配成功后，母鼠采用全程日粮限饲饥饿法建立IUGR模型[6-7]。母鼠分为正常怀孕大鼠（5只）和实验怀孕大鼠（15只），正常怀孕大鼠受孕后第1天采用基础饲料喂养，实验怀孕大鼠孕后第1天给予正常怀孕大鼠50%的进食量直至自然分娩。所生新生仔鼠出生体质量在正常新生仔鼠平均体质量减去2倍标准差以下者为IUGR新生鼠。

1.4 分组与干预方法选择21 d仔鼠进行断奶分组，随机分为健康组（健康仔鼠）、IUGR组（IUGR仔鼠）、健康+姜黄素组（健康仔鼠+基础饲料+400 mg/kg姜黄素）、IUGR+姜黄素组（IUGR仔鼠+400 mg/kg姜黄素），每组10只。健康组及IUGR组按照基础饲料喂养，健康+姜黄素组及IUGR+姜黄素组饲喂基础饲料+400 mg/kg的姜黄素[7]，基础饲料质量百分比：蛋白质（22.70%）、粗脂肪（5.54%）、赖氨酸（1.25%）、蛋氨酸（0.40%）、钙（1.24%）、磷（1.07%）。饲养12周。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 血糖、血脂指标检测各组仔鼠干预结束后次日清晨称质量后采集尾部静脉血，采用血糖仪快速检测血糖。再抽取全血，静置5 min后，以3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，收集血清，采用相关试剂盒检测TC、CHO、LDL-C及HDL-C水平。

1.5.2 组织保本采集采血后将各组仔鼠全部固定于手术台上，以2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后处死。剪开腹腔，快速分离胰腺，生理盐水冲洗，放入4%甲醛中用于HE染色、TUNEL染色及免疫组织化学染色，置于液氮中用于免疫印迹实验。

1.5.3 HE染色法观察仔鼠胰腺发育情况将胰腺组织浸泡于10%甲醛溶液中固定过夜，石蜡包埋后4 μm切片，二甲苯脱蜡后100%-95%-85%及75%乙醇进行逐层脱水，苏木素染色，盐酸（1%）处理，伊红复染，100%-95%-85%及75%乙醇脱水。封片后显微镜下观察胰腺组织形态。

1.5.4 TUNEL染色法观察仔鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡情况取胰腺组织石蜡切片，具体步骤按TUNEL检测试剂盒说明书进行。封片后，荧光显微镜下观察凋亡细胞呈绿色，每张切片选择5个非重叠视野，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞个数/总细胞个数×100%。

1.5.5 免疫组织化学法检测仔鼠胰腺组织Ngn3及Caspase-3阳性细胞数取胰腺组织石蜡切片脱蜡，经50%、80%、90%乙醇梯度脱水，二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）透明，各1～2 min；以3%过氧化氢处理15 min，PBS洗2～3次，各5 min；pH6.0柠檬酸盐抗原修复，水浴消除内源性过氧化物酶活性，用含3%正常山羊血清的PBS孵育20 min；加入兔抗鼠Ngn3（1∶300稀释）、Caspase-3（1∶500稀释）等一抗，4℃孵育过液；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（1∶300），37℃孵育30 min；DAB法显色；依次干燥，95%乙醇、无水乙醇脱水，透明、中性树胶封片。显微镜观察，取5个视野，每个视野计数100个细胞，棕褐色均染或颗粒判为阳性细胞，Ngn3及Caspase-3阳性均表达于细胞质中，计算阳性细胞百分比。

1.5.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测仔鼠胰腺组织Ngn3、Caspase-3蛋白表达水平取胰腺组织加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液裂解，离心取上清液，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量法测定蛋白浓度。将蛋白调整至等浓度后，用电泳仪进行电泳，条件为浓缩胶80 V，分离胶120 V。电泳完成后进行转膜。转膜终止后，用PBS缓冲液冲洗5 min。丽春红染膜，观察转膜效果。然后用PBS将丽春红冲洗干净，用封闭液封闭1.5 h，加入稀释的Ngn3（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、GAPDH等一抗，4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），孵育90 min后PBS洗涤。电化学发光（ECL）试剂盒曝光显影3 min。应用ImageJ软件分析Ngn3、Caspase-3蛋白与GAPDH灰度值的比值，表示Ngn3和Caspase-3的蛋白相对表达量。

1.6 统计方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组仔鼠血糖及血脂代谢水平比较表1结果显示：健康组和健康+姜黄素组2组间空腹血糖、TG、CHO、LHL-C及HDL-C水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与健康组比较，IUGR组仔鼠空腹血糖、TG及LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低（均P＜0.05）；与IUGR组比较，IUGR+姜黄素组仔鼠空腹血糖、TG及LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（均P＜0.05）。各组仔鼠CHO水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明姜黄素可改善IUGR仔鼠糖脂代谢。

表1 各组仔鼠血糖及血脂代谢水平比较Table 1 Comparison of the blood glucose and glucolipid metabolism levels of newborn rats among various groups （±s，mmol·L-1）

表1 各组仔鼠血糖及血脂代谢水平比较Table 1 Comparison of the blood glucose and glucolipid metabolism levels of newborn rats among various groups （±s，mmol·L-1）

①P＜0.05，与健康组比较；②P＜0.05，与健康+姜黄素组比较；③P＜0.05，与IUGR组比较

组别健康组健康+姜黄素组IUGR组IUGR+姜黄素组F值P值鼠数/只10 10 10 10空腹血糖5.84±0.64 5.71±0.67 7.84±0.80①②6.30±0.58①②③20.860＜0.001 TG 0.39±0.09 0.41±0.11 0.89±0.20①②0.62±0.15①②③26.230＜0.001 CHO 1.38±0.54 1.42±0.48 1.72±0.25 1.55±0.33 1.355 0.272 LDL-C 0.65±0.20 0.70±0.18 0.91±0.25①②0.83±0.24①②③2.942 0.046 HDL-C 0.66±0.20 0.68±0.18 0.38±0.15①②0.54±0.13①②③6.810 0.001

2.2 各组仔鼠胰腺发育情况比较图1结果显示：健康组和健康+姜黄素组仔鼠胰腺组织排列紧密，胰岛、腺泡及导管结构清晰，胰岛数目较多；IUGR组仔鼠胰岛体积减小，数目较少、结构松散且分布不规则；与IUGR组比较，IUGR+姜黄素组仔鼠胰岛数目增加、面积增大、结构较清晰饱满。表明姜黄素可以改善IUGR仔鼠胰腺病理损伤，促进胰腺发育。

图1 各组仔鼠胰腺组织形态比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of newborn rat pancreatic tissues among various groups（by HE staining，×200）

2.3 各组仔鼠胰腺组织中胰岛β细胞凋亡程度比较图2结果显示：健康组、健康+姜黄素组、IUGR组及IUGR+姜黄素组仔鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡率分别为（3.42±0.50）%、（3.11±0.54）%、（21.22±2.55）%及（14.53±2.04）%，多组间比较存在差异（F=280.500，P＜0.001）。进一步比较：健康组和健康+姜黄素组2组间胰岛β细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与健康组比较，IUGR组胰岛β细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与IUGR组比较，IUGR+姜黄素组胰岛β细胞凋亡率降低（P＜0.05）。表明姜黄素可以抑制IUGR仔鼠胰岛β细胞凋亡。

图2 各组仔鼠胰腺组织中凋亡胰岛β细胞分布情况比较（TUNEL法，×200）Figure 2 Comparison of the islet β cell apoptosis in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by TUNEL method，×200）

2.4 各组仔鼠胰腺组织中Ngn3、Caspase-3阳性细胞数比较表2、图3、图4结果显示：健康组和健康+姜黄素组2组间胰腺组织Ngn3及Caspase-3阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与健康组比较，IUGR组胰腺组织Ngn3阳性细胞数降低，Caspase-3阳性细胞数升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与IUGR组比较，IUGR+姜黄素组Ngn3阳性细胞数升高，Caspase-3阳性细胞数降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明姜黄素可以促进IUGR仔鼠胰腺组织中胰腺发育相关蛋白Ngn3表达及抑制凋亡效应蛋白Caspase-3阳性表达。

图4 各组仔鼠胰腺组织中Caspase-3阳性细胞分布情况比较（免疫组织化学法，×200）Figure 4 Comparison of the distribution of Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各组仔鼠胰腺组织中Ngn3、Caspase-3阳性细胞数比较Table 2 Comparison of the number of Ngn3 and Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

表2 各组仔鼠胰腺组织中Ngn3、Caspase-3阳性细胞数比较Table 2 Comparison of the number of Ngn3 and Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

①P＜0.05，与健康组比较；②P＜0.05，与健康+姜黄素组比较；③P＜0.05，与IUGR组比较

组别健康组健康+姜黄素组IUGR组IUGR+姜黄素组F值P值鼠数/只10 10 10 10 Ngn3阳性细胞数/个15.65±1.50 16.20±1.62 5.22±0.71①②11.34±1.23①②③149.600＜0.001 Caspase-3阳性细胞数/个4.05±0.70 3.86±0.85 20.41±3.40①②13.80±2.04①②③153.400＜0.001

图3 各组仔鼠胰腺组织中Ngn3阳性细胞分布情况比较（免疫组织化学法，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of Ngn3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by immunohistochemical method，×200）

2.5 各组仔鼠胰腺组织Ngn3、Caspase-3蛋白表达水平比较表3、图5结果显示：健康组和健康+姜黄素组2组间胰腺组织Ngn3、Caspase-3蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与健康组比较，IUGR组胰腺组织Ngn3蛋白表达水平降低，Caspase-3蛋白表达水平升高（均P＜0.05）；与IUGR组比较，IUGR+姜黄素组胰腺组织Ngn3蛋白表达水平升高，Caspase-3蛋白表达水平降低（均P＜0.05）。表明姜黄素可以促进IUGR仔鼠胰腺组织中胰腺发育相关蛋白Ngn3表达及抑制凋亡效应蛋白Caspase-3的表达。

表3 各组仔鼠胰腺组织Ngn3及Caspase-3蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of the protein expression levels of Ngn3 and Caspase-3 in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

表3 各组仔鼠胰腺组织Ngn3及Caspase-3蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of the protein expression levels of Ngn3 and Caspase-3 in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

①P＜0.05，与健康组比较；②P＜0.05，与健康+姜黄素组比较；③P＜0.05，与IUGR组比较

组别健康组健康+姜黄素组IUGR组IUGR+姜黄素组F值P值鼠数/只10 10 10 10 Ngn3蛋白相对表达量1.50±0.22 1.63±0.25 0.52±0.08①②0.89±0.17①②③74.460＜0.001 Caspase-3蛋白相对表达量1.02±0.14 0.95±0.20 2.41±0.45①②1.55±0.32①②③49.830＜0.001

图5 各组仔鼠胰腺组织Ngn3（A）、Caspase-3（B）蛋白的Western Blot电泳条带图Figure 5 Western Blot analysis of protein Ngn3（A）and Caspase-3（B）in newborn rat pancreatic tissues in various groups

3 讨论

正常胎儿发育过程中胰岛β细胞凋亡时伴随着胰岛细胞新生，能够通过引起胰岛素的释放而维持糖分的摄取，有利于胰腺发育及能量代谢。胚胎中晚期时存在胰岛重构，宫内环境会对胰岛功能发挥重要影响，当胎儿早期如出现营养不良，可导致胎儿胰岛β细胞数目减少及功能异常[8]。近些年，随着对宫内发育迟缓（IUGR）发生机制的研究，发现胰岛功能不足可影响胎儿对糖分摄取不足，导致生长缓慢及体质量降低，且成年后IUGR伴随糖尿病、肥胖及代谢综合征的风险显著升高，表明IUGR可对整个生命周期产生影响[9]。有研究[10]表明，母体营养不良的IUGR仔鼠胰岛β细胞数目减少，可导致胰腺功能障碍。Caspase属于特异性切割天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡的主要调节因子。Caspase-3属于家族成员凋亡执行因子，正常情况下Caspase-3以还原酶形式存在于机体细胞中，当IUGR发生后，其受到外界氧化应激等多种因素刺激后可被激活，发挥降解细胞核及细胞骨架诱导其胰岛β细胞凋亡的作用[11-12]。现代医家多将“胰腺”归属于中医“脾”的范畴[13]，而姜黄素归脾、肝经，从此角度，亦可见选择姜黄素治疗IUGR胰腺发育存在一定的适配度。本研究结果显示，IUGR组仔鼠胰岛β细胞数目较健康组降低、胰腺组织Caspase-3表达较健康组升高，而IUGR+姜黄素组胰岛β细胞数目较IUGR组增加、胰腺组织Caspase-3表达较IUGR组降低，表明姜黄素能够减少IUGR仔鼠胰岛β细胞凋亡，对胰腺损伤有改善作用。

在胰腺发育过程中，内分泌细胞产生于Ngn3标记的胰腺祖细胞[14]。胰腺发育相关蛋白Ngn3，属于碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）家族的转录因子，对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要，且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质[15]。Ngn3基因及其转录调控网络对胰岛的形成、成熟胰岛细胞命运的维持起重要的调控作用[16]。Ngn3缺失小鼠存在内分泌功能障碍，主要表现为多种胰岛细胞和内分泌前体细胞在各个阶段都出现缺失，导致小鼠在围生期发生死亡[17]。孕期全程低蛋白饮食的营养不良可致大鼠发生IUGR，并影响胰腺中Ngn3的表达，Ngn3表达下降可能导致胰腺β细胞分化及功能成熟障碍，进而导致胰腺发育不良，胰岛数量及面积相应减少[18]。本研究结果显示，IUGR组仔鼠胰腺组织Ngn3表达较健康组降低，IUGR+姜黄素组仔鼠胰腺组织Ngn3表达较IUGR组升高，表明姜黄素可上调Ngn3促进胰腺发育。

另外，经研究证实，IUGR是导致血糖升高及血脂水平异常的危险因素。当IUGR时，患儿血脂指标如TG、LHL-C等水平降低，随着患儿生长，下丘脑食欲调节网络出现异常可使摄食增加，出现血脂异常[19]。本研究结果显示，IUGR组仔鼠血糖及血脂指标水平较健康组升高，IUGR+姜黄素组仔鼠上述指标则降低，表明姜黄素能够改善IUGR仔鼠糖脂代谢紊乱。

综上所述，IUGR仔鼠存在糖脂代谢紊乱、胰腺结构发育不良及胰岛β细胞凋亡加剧，姜黄素能够调节IUGR仔鼠糖脂代谢，这可能与其抑制凋亡效应分子Caspase-3表达，上调Ngn3活性有关。