凯里红酸汤细菌群落多样性分析及其优势乳酸菌筛选

宫路路，李晓然，陈芳勇，王若曦，李洁*

(1.遵义医药高等专科学校 医学技术系，贵州 遵义 563000；2.昆明理工大学 生命科学与技术学院，昆明 650500)

酸汤作为黔东南苗族、侗族的传统发酵食品，在当地乃至贵州十分流行。酸汤种类很多，占主导地位的有红酸汤和白酸汤。红酸汤主要由野生毛辣角(野生西红柿)、当地的辣椒以及糯米为主要原料发酵而成[1]。红酸汤可以作为配料、调味品制作酸汤火锅，有着独特的色、香、味，能大大增进人们的食欲[2]。研究报道表明，酸汤具有开胃健脾、降脂减肥等作用[3]。凯里红酸汤火锅底料、内蒙古涮羊肉火锅底料以及重庆火锅底料被誉为中国三大特色火锅底料。白酸汤主要由米汤或淘米水放在火塘边自然发酵而成[4]。白酸汤可作为夏季的解暑饮料，清凉爽口，风味独特；用白酸汤为主要调味料制作凯里酸汤鱼，名扬中外[5]。当地有句俗语叫“三天不吃酸、走路打蹿蹿”[6]，可见人们对酸汤的喜爱。

目前凯里酸汤的研究主要集中在发酵工艺以及发酵动力学[7-9]、酸汤中分离微生物的抗氧化活性、营养成分分析、风味物质分析[10-11]、烹调方法对红酸汤全反式番茄红素含量的影响[12-14]、可培养微生物及其优势微生物筛选[15]、酸汤对动物肠道微生物的影响[16-17]以及酸汤口服液的开发[18]等方面。近年来，高通量测序技术(Illumina MiSeq)发展迅猛，逐渐应用到酸汤微生物群落结构多样性分析中[19-20]，极大地促进了人们对酸汤中微生物组成的了解。其结果可指导酸汤中优势微生物分离，进行纯菌种发酵研究。郑莎莎等研究了干酪乳杆菌H1发酵红酸汤，探索了该菌对红酸汤品质以及特征代谢物的影响[21]。

本研究从凯里市采集到了3个酸汤样品。通过高通量测序技术分析样品中细菌群落种类多样性。根据多样性分析结果，有目的地筛选酸汤中优势菌种，并对其进行分子生物学鉴定，为红酸汤的进一步纯菌种发酵研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 样品收集

从凯里市采集到3个酸汤样品，分别命名为ST9、ST10和ST22。ST9和ST10样品为从凯里市某农贸市场采集的传统发酵红酸汤；ST22为凯里市某知名品牌生产的红酸汤。样品采集后装入50 mL离心管中进行收集，置于便携式冰盒中，随后立即运到实验室，于4 ℃冰箱中保存。

1.2 实验试剂

DNA提取裂解缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖；TE 缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；Premix Ex TaqTM：大连Takara公司；DNA 纯化回收试剂盒：QIAquick Gel Extraction Kit；MRS合成培养基：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；琼脂糖：生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油：天津试剂三厂。

1.3 实验仪器

超净工作台 苏净集团安泰公司；ZB-1090制冰机、普通冰箱 中科美菱低温科技股份有限公司；ABI 7200 PCR仪 美国ABI公司；水平电泳仪 Bio-Rad公司；微量移液器 德国Eppendorf公司；制胶板 北京六一仪器厂；凝胶成像系统 德国Syngen公司；罗氏GS-FLX测序仪 瑞士Roche公司；3-18K离心机 美国Sigma公司；Labnet 230V EU涡旋仪 美国Labnet公司；高压灭菌锅 日本TOMY公司。

1.4 数据库及分析软件

Silva(Release 132，http://www.arb-silva.de)；mothur(version 1.41.1, http://www.mothur.org/)。

1.5 实验方法

1.5.1 DNA提取

改良Schmidt等的方法，进行样品DNA提取[22-23]。提取的DNA采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测提取质量，将提取质量合格的DNA样品保存，不合格样品重新提取DNA，以得到合格的DNA样品。

1.5.2 细菌16S rDNA区域目的基因扩增

使用细菌16S rDNA通用引物，扩增细菌V3～V4区域。引物序列：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

以提取的细菌基因组DNA为模板，进行目的基因PCR扩增，扩增体系：Premix Ex TaqTM聚合酶10 μL，模板基因组DNA， 0.5 μL，目的基因上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，30个循环，72 ℃延伸5 min。

吸取上述PCR扩增产物5 μL，用去离子水稀释10倍，再按照原反应条件扩增5个循环，减少PCR产物非特异性扩增[24]，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，-20 ℃保存PCR产物备用。

1.5.3 测序结果分类鉴定

根据barcode将测序序列分配到对应的样品中，去除barcode以及引物序列得到有效序列。使用mothur v1.43.1软件包MiSeq SOP进行序列拼接，去除质量欠佳的序列，保留长度大于400 bp的序列。运用mothur v1.43.1软件classify.seqs命令分析，结合Silva的SSU rRNA序列数据库V138分类信息[25]得到序列分类数据。

1.5.4 α多样性指数分析

使用mothur中classify.seqs命令获得样品中微生物的群落结构，rarefaction.single命令得到微生物Chao1、Refaction和ACE等指数。以同源性为97%划分可操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。根据以上处理计算样品ACE、Chao1、Shannon以及覆盖度，绘制Rarefaction曲线。

1.5.5 酸汤中微生物分离与保存

MRS培养基是分离乳酸菌的选择性培养基。结合上述样品多样性分析，在属水平上，酸汤中的优势微生物为乳杆菌属。亦有研究发现红酸汤中主要发酵菌群为乳酸菌[26]。类比肖甜甜等参考高通量分析进行白酸汤中优势微生物筛选，本研究采用MRS选择性培养基有目的地分离传统发酵红酸汤中优势乳酸菌。

取1 mL酸汤液体，经无菌生理盐水进行梯度稀释，吸取20 μL稀释倍数为10-6的稀释液涂布于MRS琼脂平板，35 ℃静置培养24 h。挑取具有不同形状、大小的单菌落，在MRS琼脂平板上进行划线，35 ℃静置培养24 h。挑取不同生长形态的单菌落至5 mL MRS液体试管中进行培养。结束后，加入30% 甘油置于-80 ℃保存。

1.5.6 酸汤中细菌基因组DNA提取

将1.5.5中保存的菌株进行解冻，利用微量移液器吸取20 μL菌液，接种到含有5 mL MRS液体培养基的试管中，置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h。培养出的菌液采用改良CTAB法提取该菌株基因组DNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，保存合格的DNA备用。

1.5.7 酸汤中细菌分子生物学鉴定

以上述提取的基因组DNA为模板，加入细菌16S rRNA通用引物F27(5′-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3′)，R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增靶基因[27]。扩增体系为：Ex Taq 25.0 μL，F27和R1492引物各1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。按照程序95 ℃热变性 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 30 s，35个扩增循环，结束后72 ℃延伸10 min，以便得到足够数量的目的DNA分子。

对PCR产物进行鉴定、纯化，采用双脱氧链终止法进行序列测定。所得测序核苷酸序列提交NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，用BLAST软件与GeneBank中已知的16S rDNA核苷酸序列进行同源性比较，当被检菌株的核苷酸序列与参考菌株的同源性大于97%时，即确定为同一个菌种[28]。

2 结果与分析

2.1 样品序列信息和多样性指数

样品进行高通量测序后得到3个样品的细菌群落，见表1。按照同源性≥97%划分OTUs，3个样品的细菌群落共得到276个OTUs。比照16S rRNA的Silva数据库，将所有细菌群落分为12个细菌门，69个属。从ACE指数来看，细菌群落丰度ST10>ST9> ST22；从Shannon指数可以看出，ST22酸汤样品的多样性高于传统发酵的酸汤ST9和ST10。ST22为工业化生产的酸汤产品，推测与其发酵工艺复杂性有关。从Chao1指数可以看出，ST10的值最大，说明其群落结构丰度最高。从覆盖度可以看出，3个样品的覆盖度都比较高。

表1 基于序列相似度为97%的细菌丰度

根据Rarefaction文件绘制Rarefaction稀释曲线，见图1。

图1 序列相似度为97%的细菌Rarefaction评估

由图1可看出大部分曲线尚未达到平台期，处于一直上升的状态，说明测序得到的样品序列不能全部反映其微生物群落的多样性。然而从覆盖率数据分析，所有样品都在90%以上，最低为92%，最高达到了95%，显示样品中的主要优势微生物种类基本得到了呈现。

2.2 细菌群落多样性分析

将3个样品序列与Silva SSU rRNA 数据比对，发现其细菌群落具有一定差异性。由图2可知，ST9中检测到5个门，分别为Firmicutes， Proteobacteria，Actinobacteriota， Bacteroidota， Patescibacteria。其中厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，其序列数占总序列数的86.16%，其次是变形菌门(Proteobacteria)，占比13.32%，其余门的占比低于0.4%。ST10中检测到9个门，分别为Firmicutes，Proteobacteria，Actinobacteriota，Bacteroidota，Bacteria_unclassified，Bdellovibrionota，Campilobacterota，Patescibacteria，Deinococcota。其中厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，其序列数占总序列数的92.81%，占有绝对优势；其次是变形菌门(Proteobacteria)，占比5.71%，其余门的占比低于0.6%。ST22中检测到4个门，分别为Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidota， Actinobacteriota。其中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门，其序列数分别占总序列数的54.81%和39.77%，其他两个分别为Bacteroidota占比4.55%，Actinobacteriota占比0.87%。对比上述结果，3个样品菌群结构存在着很大差异，但基本优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，与王琪琪等研究的红酸汤中优势菌门基本一致。

图2 酸汤样品中细菌在门的分类水平分布

由图3可知，在属的分类水平上，ST9酸汤样品中有44个属，乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度最高，达42%，其他属所占比例小于3.00%(最大为2.04%)。ST10酸汤样品中有44个属，乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度最高(83.50%)；其次为假单胞菌属(Catenococcus，7.74%)，其他属所占比例小于2.00%(最大为1.27%)。ST22酸汤样品中有45个属，各个属占比较均匀。假单胞菌属(Catenococcus)占比最高(16.27%)，其次为芽孢杆菌属(Bacillus，16.73%)，Aeribacillus占比5.50%，Staphylococcus占比4.95%，Proteus占比4.80%，Halomonas占比4.74%，Lactobacillus占比4.51%，Stenotrophomonas占比3.57%，Lelliottia占比2.40%。可见，属的总数相差不大，但相应各属所占比例各不相同。ST9和ST10优势比较明显的属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)，ST22优势菌属为假单胞菌属(Catenococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)，其他属占比较少。

图3 酸汤样品中细菌在属的分类水平分布

2.3 MRS平板涂布培养结果

将酸汤样品ST9、ST10和ST22进行一定稀释，然后在超净工作台中涂布MRS琼脂平板，在恒温培养箱中培养(部分结果见图4中a和b)。

图4 MRS琼脂培养基细菌培养

由图4可知，MRS琼脂培养基上长出了乳白色菌落，各菌落形状差异不大，生长态势良好。

2.4 平板划线分离结果

从平板MRS琼脂培养基上挑取单菌落，然后进行MRS琼脂平板划线分离菌株。部分菌株的划线分离结果见图5。

图5 细菌平板划线分离

由图5可知，部分菌落离散性不是很好，应进一步划线分离。

2.5 菌种鉴定结果

结合纯培养技术，从样品ST9中分离得到12株细菌，分别为2株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、1株Weissellaminorgene、9株枯草杆菌(Bacillussp.)。从样品ST10中分离得到14株菌，分别为11株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、1株溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、1株戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、1株肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)；从样品ST22中分离得到3株菌，分别为2株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、1株芽孢杆菌(Bacillussp.)，见表2。

表2 菌种鉴定结果

3 结论

从高通量测序分析到乳酸菌分离鉴定来看，传统发酵酸汤中细菌种类多样性低于工业化生产的酸汤产品。高通量测序分析显示酸汤中优势菌为乳杆菌和芽孢杆菌，与纯培养分离的结果基本一致。工业化生产的酸汤细菌多样性丰富，可造就酸汤丰富多样的口味。多样化的细菌种类对酸汤的风味影响很大，使工业化酸汤占有很大优势。

从可培养技术来看，酸汤样品中分离得到的细菌多为乳酸菌和芽孢杆菌。在酸汤发酵后期，乳酸菌是酸汤发酵的主要微生物[29]。呈现出生长繁殖加快，可形成酸性低pH发酵环境；同时乳酸菌在生长过程中可产生一些抑菌物质，抑制其他腐败菌生长，并能够对酸汤风味形成起到重要作用[30]。同时在3个样品中也分离到了一些芽孢杆菌。研究报道表明，芽孢杆菌在食品发酵中起着重要的作用。芽孢杆菌具有丰富的酶类系统[31]，为生产丰富多样的酸汤风味奠定了基础，可生产出具有理想感官特性的发酵食品[32]，是一类具有潜力的益生菌[33]。自然发酵的酸汤品质受家庭作坊生产习惯的影响较大，一定程度上影响酸汤产品风味，造成品质不均的现象。采用微生物纯培养技术，从传统发酵中筛选优势乳酸菌作为发酵剂，是未来酸汤生产的一个方向。大自然中微生物资源丰富，从传统发酵酸汤中寻找微生物资源，得到适合酸汤发酵生产的发酵剂，生产出品质稳定、具有独特风味的酸汤，可以很好地促进凯里酸汤名片的打造，对于推广凯里酸汤起到促进作用。