基于主成分及聚类分析的不同香精香料品质综合评价研究

邵佩，刘吟，明翠梅，刘兴乐，谢超*

(1.武汉黄鹤楼香精香料有限公司，武汉 430040；2.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040)

香精香料在日常生活及食品工业中应用广泛[1]，主要作为改善、丰富食品香气和香味的食品添加剂[2]，可被用于食品、酒类、卷烟、日化、医药等工业中[3]，具有较强的食用和药用价值[4-5]。此外，部分香精香料因具有抗氧化和抑菌作用，也被作为化妆品的重要原料[6]。香精香料也是卷烟生产过程中必不可少的原料，添加后可以改善卷烟的口感和味道，提高卷烟的品质[7]。目前，主要通过物理指标和化学成分来控制香精香料的质量，随着现代分析技术的应用发展，国内对香精香料化学成分分析方面进行了大量报道，主要包括气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]、气相/液相色谱-质谱法[11-12]等。

糖类是香精香料中的重要成分，有研究表明增加可溶性糖类含量能够有效改善风味，并且在高温燃烧时，还原糖能够分解成具有香味的简单酮类和醛类物质[13]。目前对糖类的分析方法主要有高效液相色谱法[14]、气相色谱法[15]、纸层析法[16]等，而高效液相色谱法因具有分析效率高、速度快和操作自动化程度高等优点而被广泛应用[17]。目前国内外常用于糖类的检测器有紫外检测器(UV)[18]、二极管阵列检测器(DAD)、示差折光检测器(RID)[19]、荧光检测器(FLD)[20]和蒸发光散射检测器(ELSD)[21]等，但UV、DAD和FLD需要柱前衍生，操作复杂；RID和ELSD虽不需要柱前衍生，但RID灵敏度低，组分分析效果不好[22]，ELSD稳定性较差；CAD检测器作为一种新兴的通用型检测器，可用于检测所有非挥发性和部分半挥发性化合物，检测范围宽，在化合物无紫外吸收或较弱紫外吸收时体现出巨大的优势，能够弥补其他检测器的不足，操作简单，灵敏度和重现性更高。目前关于香精香料的相关研究主要集中在香气成分分析，用HPLC-CAD法分析香精香料中糖类化合物、香精香料品质控制与评价的相关报道较少。

香精香料的品种繁多，其化学成分和物理指标也有所不同。为了研究不同香精香料的品质差异，本研究建立了一种HPLC-CAD法用于测定香精香料中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，并对18种香精香料包括糖类在内的6个指标进行测定，通过主成分分析、聚类分析和综合评价进行品质评价，以期为香精香料品质的全面质量控制和综合评价利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

对照品D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖(纯度>99%)：由中国食品药品检定研究院提供；乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；水：超纯水；18种香精香料样品：武汉黄鹤楼香精香料有限公司抽样，其中S1～S6对应类别为XJ1；S7～S12对应类别为XJ2；S13～S18对应类别为XJ3。

1.2 主要仪器与设备

UltiMate 3000高效液相色谱仪(包括Corona Veo电喷雾检测器、Chromeleon 7.2色谱工作站) 美国ThermoFisher Scientific公司；AL204电子分析天平、T50全自动电位滴定仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-600DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Corona 1010氮气发生器 毕克气体仪器贸易(上海)有限公司；Smart-S15超纯水仪 上海和泰仪器有限公司；DMA4500-RXA170全自动密度折光仪 奥地利安东帕(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量(精确到0.0001 g)，分别置于100 mL容量瓶中，加入超纯水5 mL溶解，再加入乙腈并定容，摇匀，制得果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品储备溶液的浓度分别为5.074，5.069，5.039 mg/mL，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密称量样品约0.1 g，置于50 mL离心管中，加入25 mL水，涡旋振荡10 min，离心5 min(转速8000 r/min)后取上层清液过0.22 μm水相滤膜，即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

采用色谱柱：Agilent ZORBAX Carbohydrate(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-水(80∶20)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。CAD检测器：采集频率10 Hz；滤光片10 s；温度35 ℃；气源：氮气。

1.3.4 样品理化指标的测定

酸值参照GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》，相对密度参照GB 5009.2-2016《食品安全国家标准 食品相对密度的测定》，折光指数参照GB/T 14454.4-2008《香料 折光指数的测定》。

1.3.5 数据处理与分析

所有试验样品均测定3次，数值以平均值±标准偏差表示。用SPSS 23.0软件进行差异性分析(P<0.05)、相关性分析、主成分分析(PCA)和聚类分析，并采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相选择

在色谱条件的方法学研究中，考察了不同比例的流动相、流速和柱温等条件。通过分别采用乙腈-水为83∶17、80∶20、78∶22、75∶25、70∶30、65∶35这6种流动相比例进行试验，结果显示，增加有机相会使峰形变宽，分析时间延长，而提高水相有利于糖类的溶解，缩短分析时间，但不利于各组分的分离；综合考虑发现，当乙腈-水的比例为80∶20时，分离度合适，峰宽较小，峰高较高，在15 min内可达到良好的分离效果，因此流动相选择乙腈-水为80∶20(体积比)。

2.1.2 流速及柱温选择

同时，考察了0.8，1.0，1.2 mL/min 3种流速及不同柱温(25，30，35 ℃)对色谱峰分离效果的影响。结果显示，当流速为0.8 mL/min时，分析时间延长，峰宽较大；而当流速增大时，分析时间缩短，峰宽变小，综合考虑，选择流速为1.0 mL/min，此时保留时间适宜，分离度好，峰宽较小；而柱温对保留时间、峰宽、峰高及分离度则无明显影响，最终选择与试验环境接近的30 ℃作为柱温。

2.1.3 CAD检测器参数选择

在CAD检测器的方法学研究中，对检测器的采集频率和滤光片常数进行了考察。通过选择采集频率(5，10，20 Hz)进样分析，结果显示，采集频率对色谱峰的平滑度无影响，因此选用采集频率10 Hz。同时考察滤光片常数1.0，2.0，3.6，5，10 s对色谱峰的影响，结果显示，其数值越大，峰越平滑，因此选用滤光片常数为10 s。

2.1.4 专属性试验

取对照品溶液(果糖、葡萄糖和蔗糖溶液)以及空白溶液各10 μL，按1.3.3项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示，果糖、葡萄糖和蔗糖的分离度好，均大于1.5，空白溶剂测定时无干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 线性关系考察

取混合对照品储备液，逐步定量稀释成不同的浓度梯度。按1.3.3项下色谱条件测量，记录峰面积，以对照品浓度(X，mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，具体结果见表1。

取最小浓度梯度的对照品溶液稀释到合适倍数后进样，按1.3.3项下色谱条件进样测定，分别以信噪比(S/N)为10∶1、3∶1计算检测限和定量限，具体结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取一定质量浓度的混合对照品溶液，按1.3.3项下色谱条件连续进样6次，记录3种糖的峰面积，测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为1.87%、2.01%、1.34%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取1.3.2项下制备的供试品溶液6份，按1.3.3项下色谱条件进样测定，记录3种糖的峰面积，测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为1.92%、1.53%、2.06%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取1.3.2项下供试品溶液，分别放置0，2，4，8，16，24 h后，按1.3.3项下色谱条件进样测定，记录3种糖的峰面积，测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为2.79%、3.15%、4.01%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 加样回收率试验

称取适量样品3份，依次加入适量对照品，用水稀释至刻度，摇匀，按1.3.3项下色谱条件进样测定，并计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。3种糖的平均回收率在96.2%～99.2%之间。

表2 加标回收率试验结果(n=3)

2.4 样品单糖含量的测定

取18种香精香料样品，按1.3.2项方法制备供试品溶液，按1.3.3项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算样品中3种糖的含量，结果见表3。

表3 HPLC-CAD方法测定香精香料中3种糖类的含量

续 表

由表3和图2可知，不同种类香精香料中果糖、葡萄糖含量存在显著性差异(P<0.05)，果糖含量为0.96%～3.25%，其中S9含量最高，S14含量最低；葡萄糖含量为3.92%～11.27%，其中S10含量最高，S16含量最低；蔗糖含量为0.81%～1.47%，其中S18含量最高，S6含量最低。18种香精香料中糖类成分的含量从高到低为D-无水葡萄糖>果糖>蔗糖，其中D-无水葡萄糖含量从高到低依次为XJ2>XJ1>XJ3，果糖含量从高到低依次为XJ2>XJ1>XJ3，而不同种类蔗糖含量XJ3中最多。

图2 样品高效液相色谱图

2.5 样品理化指标的测定

相对密度、折光指数和酸值影响着香精香料的品质和风味。由表4可知，不同种类香精香料中理化指标存在显著性差异(P<0.05)，相对密度在0.9815～1.1431 g/cm3，其中S10含量最高，S17含量最低；折光指数在1.3779～1.3994，其中S10含量最高，S5含量最低；酸值在7.47～22.56 mg/g，其中S11含量最高，S15含量最低。总体而言，理化指标最高的香精香料为XJ2。

表4 不同香精香料理化性质对比

2.6 不同香精香料综合品质指标的相关性分析

对18种香精香料的综合品质进行相关性分析后，由表5可知，6种品质指标之间存在不同程度的相关性，其中折光指数和蔗糖含量、酸值和折光指数之间没有相关性，果糖与葡萄糖含量、相对密度、折光指数和酸值呈极显著正相关，与蔗糖呈极显著负相关；葡萄糖与相对密度、折光指数和酸值呈极显著正相关，与蔗糖呈极显著负相关；蔗糖与相对密度和酸值呈极显著负相关；相对密度和酸值呈显著正相关，折光指数与酸值不存在显著相关性。因此，由于18种香精香料含量差异不同，各品质指标之间均存在不同程度的相关性，仅用某一个指标来评价不同香精香料的品质是不合理的。

表5 不同香精香料品质指标之间的相关性分析

续 表

2.7 不同香精香料综合品质指标的主成分分析

2.7.1 主成分提取

以18种香精香料中糖类水解产物的葡萄糖、果糖、蔗糖及折光指数、相对密度和酸值为提取特征，导入SPSS 23.0统计软件中进行主成分分析，对18种香精香料的6种指标结果进行KMO和Bartlett检验，结果表明显著性值P<0.01，说明此研究可以采用主成分分析法[23]。香精香料主成分的特征值、累计贡献率和成分载荷矩阵分析结果见表6、表7和图3。以特征值大于1的前两个主成分累计方差贡献率为97.297%，综合了18种香精香料的6个品质指标的大部分信息，主成分1主要反映果糖、葡萄糖、相对密度和酸值，主成分2主要反映折光指数，可以用这两个主成分代替上述的6个品质指标对18种不同的香精香料进行品质综合评价[24-25]。PCA结果图显示[26]，18种样品大致分为3类，其中S1～S6为一类，S7～S12为一类，其他样品为一类。

表6 特征值及累计方差贡献率

表7 主成分载荷矩阵

图3 18种香精香料主成分得分图

2.7.2 综合评价

设提取的主成分1和主成分2得分分别为Y1、Y2，根据表6建立各成分得分模型：

Y1=0.449ZX1+0.444ZX2-0.370ZX3+0.459ZX4+0.246ZX5+0.439ZX6。

Y2=0.150ZX1+0.200ZX2+0.516ZX3-0.067ZX4+0.766ZX5-0.281ZX6。

再根据表6中提取的两个主成分所对应的方差贡献率和累计贡献率，以它们的比值为权重建立综合得分模型：

Y综合=0.806Y1+0.194Y2。

将Y1、Y2得分代入综合得分模型中，计算出不同香精香料综合品质的综合评分，并进行排名。得分越高，证明其品质越好，结果见表8。

表8 不同香精香料品质综合得分排名

续 表

由表8可知，以18个不同香精香料品种综合品质指标来说，按照综合得分排名为：S10>S9>S12>S8>S7>S11>S6>S2>S4>S3>S1>S5>S16>S18>S13>S17>S15>S14。其中XJ2类别中的6种产品得分较高，说明本研究中这类产品的综合品质较好。XJ1和XJ3的得分较低，说明其综合品质较差。

2.8 不同香精香料综合品质指标的聚类分析

香精香料品质指标的原始数据较为离散，不易对香精香料各类品质指标进行直观评价[27-28]。因此，将指标数据进行标准化处理后，采用组间联接法对18种香精香料综合品质进行系统聚类分析，结果见图4。

图4 18种香精香料品质综合评价聚类树状图

由图4可知，在欧氏距离为7.5时，18种产品可以聚为三类，S1～S6聚为一类，S7～S12聚为一类，S13～S18聚为一类[29-30]。主成分和聚类分析结果与样品的实际情况基本一致，所选成分可以完全反映不同香精香料之间的差异。

3 结论

本研究建立了HPLC-CAD法同时测定香精香料中糖类的检测方法，能在20 min内完成果糖、葡萄糖和蔗糖的分离。该方法检出限低，回收率、精密度和稳定性均能满足实际分析的需求，与DAD、ESLD检测法等相比，该方法具有灵敏度高、操作简单、不需要衍生化处理等优点，能为香精香料的全面质量控制提供参考依据。此外，本研究选取了有代表性的3个理化品质指标，使用相关性分析、主成分分析和聚类分析对不同香精香料的品质进行综合评分和排名。通过测定各指标发现，不同香精香料综合品质指标之间存在显著性差异，各有优劣，很难判别总体品质水平。对不同种类香精香料综合品质进行相关性分析发现，大部分指标之间存在显著相关性；再运用主成分分析，提取出两个主成分(特征值>1)，计算各成分得分，通过建立综合得分模型排序和聚类分析得到，XJ1类别香精香料的综合品质较好，XJ3类别综合品质较差，其他样品综合品质居中。进一步对两大主成分因子分别进行品种的聚类分析，可按照不同需求选择样品。因此，本研究可以为之后不同香精香料品种的分析提供理论依据，为香精香料质量控制和综合评价奠定基础。