基于主成分及聚类分析的不同香精香料品质综合评价研究

2022-10-13 03:19邵佩刘吟明翠梅刘兴乐谢超
中国调味品 2022年10期
关键词:果糖蔗糖葡萄糖

邵佩,刘吟,明翠梅,刘兴乐,谢超*

(1.武汉黄鹤楼香精香料有限公司,武汉 430040;2.湖北中烟工业有限责任公司,武汉 430040)

香精香料在日常生活及食品工业中应用广泛[1],主要作为改善、丰富食品香气和香味的食品添加剂[2],可被用于食品、酒类、卷烟、日化、医药等工业中[3],具有较强的食用和药用价值[4-5]。此外,部分香精香料因具有抗氧化和抑菌作用,也被作为化妆品的重要原料[6]。香精香料也是卷烟生产过程中必不可少的原料,添加后可以改善卷烟的口感和味道,提高卷烟的品质[7]。目前,主要通过物理指标和化学成分来控制香精香料的质量,随着现代分析技术的应用发展,国内对香精香料化学成分分析方面进行了大量报道,主要包括气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]、气相/液相色谱-质谱法[11-12]等。

糖类是香精香料中的重要成分,有研究表明增加可溶性糖类含量能够有效改善风味,并且在高温燃烧时,还原糖能够分解成具有香味的简单酮类和醛类物质[13]。目前对糖类的分析方法主要有高效液相色谱法[14]、气相色谱法[15]、纸层析法[16]等,而高效液相色谱法因具有分析效率高、速度快和操作自动化程度高等优点而被广泛应用[17]。目前国内外常用于糖类的检测器有紫外检测器(UV)[18]、二极管阵列检测器(DAD)、示差折光检测器(RID)[19]、荧光检测器(FLD)[20]和蒸发光散射检测器(ELSD)[21]等,但UV、DAD和FLD需要柱前衍生,操作复杂;RID和ELSD虽不需要柱前衍生,但RID灵敏度低,组分分析效果不好[22],ELSD稳定性较差;CAD检测器作为一种新兴的通用型检测器,可用于检测所有非挥发性和部分半挥发性化合物,检测范围宽,在化合物无紫外吸收或较弱紫外吸收时体现出巨大的优势,能够弥补其他检测器的不足,操作简单,灵敏度和重现性更高。目前关于香精香料的相关研究主要集中在香气成分分析,用HPLC-CAD法分析香精香料中糖类化合物、香精香料品质控制与评价的相关报道较少。

香精香料的品种繁多,其化学成分和物理指标也有所不同。为了研究不同香精香料的品质差异,本研究建立了一种HPLC-CAD法用于测定香精香料中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,并对18种香精香料包括糖类在内的6个指标进行测定,通过主成分分析、聚类分析和综合评价进行品质评价,以期为香精香料品质的全面质量控制和综合评价利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

对照品D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖(纯度>99%):由中国食品药品检定研究院提供;乙腈:色谱纯,美国Fisher公司;水:超纯水;18种香精香料样品:武汉黄鹤楼香精香料有限公司抽样,其中S1~S6对应类别为XJ1;S7~S12对应类别为XJ2;S13~S18对应类别为XJ3。

1.2 主要仪器与设备

UltiMate 3000高效液相色谱仪(包括Corona Veo电喷雾检测器、Chromeleon 7.2色谱工作站) 美国ThermoFisher Scientific公司;AL204电子分析天平、T50全自动电位滴定仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ-600DB超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Corona 1010氮气发生器 毕克气体仪器贸易(上海)有限公司;Smart-S15超纯水仪 上海和泰仪器有限公司;DMA4500-RXA170全自动密度折光仪 奥地利安东帕(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称取果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品适量(精确到0.0001 g),分别置于100 mL容量瓶中,加入超纯水5 mL溶解,再加入乙腈并定容,摇匀,制得果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖对照品储备溶液的浓度分别为5.074,5.069,5.039 mg/mL,备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密称量样品约0.1 g,置于50 mL离心管中,加入25 mL水,涡旋振荡10 min,离心5 min(转速8000 r/min)后取上层清液过0.22 μm水相滤膜,即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

采用色谱柱:Agilent ZORBAX Carbohydrate(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相:乙腈-水(80∶20);柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL。CAD检测器:采集频率10 Hz;滤光片10 s;温度35 ℃;气源:氮气。

1.3.4 样品理化指标的测定

酸值参照GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》,相对密度参照GB 5009.2-2016《食品安全国家标准 食品相对密度的测定》,折光指数参照GB/T 14454.4-2008《香料 折光指数的测定》。

1.3.5 数据处理与分析

所有试验样品均测定3次,数值以平均值±标准偏差表示。用SPSS 23.0软件进行差异性分析(P<0.05)、相关性分析、主成分分析(PCA)和聚类分析,并采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 流动相选择

在色谱条件的方法学研究中,考察了不同比例的流动相、流速和柱温等条件。通过分别采用乙腈-水为83∶17、80∶20、78∶22、75∶25、70∶30、65∶35这6种流动相比例进行试验,结果显示,增加有机相会使峰形变宽,分析时间延长,而提高水相有利于糖类的溶解,缩短分析时间,但不利于各组分的分离;综合考虑发现,当乙腈-水的比例为80∶20时,分离度合适,峰宽较小,峰高较高,在15 min内可达到良好的分离效果,因此流动相选择乙腈-水为80∶20(体积比)。

2.1.2 流速及柱温选择

同时,考察了0.8,1.0,1.2 mL/min 3种流速及不同柱温(25,30,35 ℃)对色谱峰分离效果的影响。结果显示,当流速为0.8 mL/min时,分析时间延长,峰宽较大;而当流速增大时,分析时间缩短,峰宽变小,综合考虑,选择流速为1.0 mL/min,此时保留时间适宜,分离度好,峰宽较小;而柱温对保留时间、峰宽、峰高及分离度则无明显影响,最终选择与试验环境接近的30 ℃作为柱温。

2.1.3 CAD检测器参数选择

在CAD检测器的方法学研究中,对检测器的采集频率和滤光片常数进行了考察。通过选择采集频率(5,10,20 Hz)进样分析,结果显示,采集频率对色谱峰的平滑度无影响,因此选用采集频率10 Hz。同时考察滤光片常数1.0,2.0,3.6,5,10 s对色谱峰的影响,结果显示,其数值越大,峰越平滑,因此选用滤光片常数为10 s。

2.1.4 专属性试验

取对照品溶液(果糖、葡萄糖和蔗糖溶液)以及空白溶液各10 μL,按1.3.3项下色谱条件进行测定,记录色谱图。结果显示,果糖、葡萄糖和蔗糖的分离度好,均大于1.5,空白溶剂测定时无干扰,见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 线性关系考察

取混合对照品储备液,逐步定量稀释成不同的浓度梯度。按1.3.3项下色谱条件测量,记录峰面积,以对照品浓度(X,mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程,具体结果见表1。

取最小浓度梯度的对照品溶液稀释到合适倍数后进样,按1.3.3项下色谱条件进样测定,分别以信噪比(S/N)为10∶1、3∶1计算检测限和定量限,具体结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取一定质量浓度的混合对照品溶液,按1.3.3项下色谱条件连续进样6次,记录3种糖的峰面积,测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为1.87%、2.01%、1.34%,表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取1.3.2项下制备的供试品溶液6份,按1.3.3项下色谱条件进样测定,记录3种糖的峰面积,测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为1.92%、1.53%、2.06%,表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取1.3.2项下供试品溶液,分别放置0,2,4,8,16,24 h后,按1.3.3项下色谱条件进样测定,记录3种糖的峰面积,测得果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积RSD分别为2.79%、3.15%、4.01%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 加样回收率试验

称取适量样品3份,依次加入适量对照品,用水稀释至刻度,摇匀,按1.3.3项下色谱条件进样测定,并计算回收率和相对标准偏差,结果见表2。3种糖的平均回收率在96.2%~99.2%之间。

表2 加标回收率试验结果(n=3)

2.4 样品单糖含量的测定

取18种香精香料样品,按1.3.2项方法制备供试品溶液,按1.3.3项下色谱条件进样测定,记录峰面积并按外标法计算样品中3种糖的含量,结果见表3。

表3 HPLC-CAD方法测定香精香料中3种糖类的含量

续 表

由表3和图2可知,不同种类香精香料中果糖、葡萄糖含量存在显著性差异(P<0.05),果糖含量为0.96%~3.25%,其中S9含量最高,S14含量最低;葡萄糖含量为3.92%~11.27%,其中S10含量最高,S16含量最低;蔗糖含量为0.81%~1.47%,其中S18含量最高,S6含量最低。18种香精香料中糖类成分的含量从高到低为D-无水葡萄糖>果糖>蔗糖,其中D-无水葡萄糖含量从高到低依次为XJ2>XJ1>XJ3,果糖含量从高到低依次为XJ2>XJ1>XJ3,而不同种类蔗糖含量XJ3中最多。

图2 样品高效液相色谱图

2.5 样品理化指标的测定

相对密度、折光指数和酸值影响着香精香料的品质和风味。由表4可知,不同种类香精香料中理化指标存在显著性差异(P<0.05),相对密度在0.9815~1.1431 g/cm3,其中S10含量最高,S17含量最低;折光指数在1.3779~1.3994,其中S10含量最高,S5含量最低;酸值在7.47~22.56 mg/g,其中S11含量最高,S15含量最低。总体而言,理化指标最高的香精香料为XJ2。

表4 不同香精香料理化性质对比

2.6 不同香精香料综合品质指标的相关性分析

对18种香精香料的综合品质进行相关性分析后,由表5可知,6种品质指标之间存在不同程度的相关性,其中折光指数和蔗糖含量、酸值和折光指数之间没有相关性,果糖与葡萄糖含量、相对密度、折光指数和酸值呈极显著正相关,与蔗糖呈极显著负相关;葡萄糖与相对密度、折光指数和酸值呈极显著正相关,与蔗糖呈极显著负相关;蔗糖与相对密度和酸值呈极显著负相关;相对密度和酸值呈显著正相关,折光指数与酸值不存在显著相关性。因此,由于18种香精香料含量差异不同,各品质指标之间均存在不同程度的相关性,仅用某一个指标来评价不同香精香料的品质是不合理的。

表5 不同香精香料品质指标之间的相关性分析

续 表

2.7 不同香精香料综合品质指标的主成分分析

2.7.1 主成分提取

以18种香精香料中糖类水解产物的葡萄糖、果糖、蔗糖及折光指数、相对密度和酸值为提取特征,导入SPSS 23.0统计软件中进行主成分分析,对18种香精香料的6种指标结果进行KMO和Bartlett检验,结果表明显著性值P<0.01,说明此研究可以采用主成分分析法[23]。香精香料主成分的特征值、累计贡献率和成分载荷矩阵分析结果见表6、表7和图3。以特征值大于1的前两个主成分累计方差贡献率为97.297%,综合了18种香精香料的6个品质指标的大部分信息,主成分1主要反映果糖、葡萄糖、相对密度和酸值,主成分2主要反映折光指数,可以用这两个主成分代替上述的6个品质指标对18种不同的香精香料进行品质综合评价[24-25]。PCA结果图显示[26],18种样品大致分为3类,其中S1~S6为一类,S7~S12为一类,其他样品为一类。

表6 特征值及累计方差贡献率

表7 主成分载荷矩阵

图3 18种香精香料主成分得分图

2.7.2 综合评价

设提取的主成分1和主成分2得分分别为Y1、Y2,根据表6建立各成分得分模型:

Y1=0.449ZX1+0.444ZX2-0.370ZX3+0.459ZX4+0.246ZX5+0.439ZX6。

Y2=0.150ZX1+0.200ZX2+0.516ZX3-0.067ZX4+0.766ZX5-0.281ZX6。

再根据表6中提取的两个主成分所对应的方差贡献率和累计贡献率,以它们的比值为权重建立综合得分模型:

Y综合=0.806Y1+0.194Y2。

将Y1、Y2得分代入综合得分模型中,计算出不同香精香料综合品质的综合评分,并进行排名。得分越高,证明其品质越好,结果见表8。

表8 不同香精香料品质综合得分排名

续 表

由表8可知,以18个不同香精香料品种综合品质指标来说,按照综合得分排名为:S10>S9>S12>S8>S7>S11>S6>S2>S4>S3>S1>S5>S16>S18>S13>S17>S15>S14。其中XJ2类别中的6种产品得分较高,说明本研究中这类产品的综合品质较好。XJ1和XJ3的得分较低,说明其综合品质较差。

2.8 不同香精香料综合品质指标的聚类分析

香精香料品质指标的原始数据较为离散,不易对香精香料各类品质指标进行直观评价[27-28]。因此,将指标数据进行标准化处理后,采用组间联接法对18种香精香料综合品质进行系统聚类分析,结果见图4。

图4 18种香精香料品质综合评价聚类树状图

由图4可知,在欧氏距离为7.5时,18种产品可以聚为三类,S1~S6聚为一类,S7~S12聚为一类,S13~S18聚为一类[29-30]。主成分和聚类分析结果与样品的实际情况基本一致,所选成分可以完全反映不同香精香料之间的差异。

3 结论

本研究建立了HPLC-CAD法同时测定香精香料中糖类的检测方法,能在20 min内完成果糖、葡萄糖和蔗糖的分离。该方法检出限低,回收率、精密度和稳定性均能满足实际分析的需求,与DAD、ESLD检测法等相比,该方法具有灵敏度高、操作简单、不需要衍生化处理等优点,能为香精香料的全面质量控制提供参考依据。此外,本研究选取了有代表性的3个理化品质指标,使用相关性分析、主成分分析和聚类分析对不同香精香料的品质进行综合评分和排名。通过测定各指标发现,不同香精香料综合品质指标之间存在显著性差异,各有优劣,很难判别总体品质水平。对不同种类香精香料综合品质进行相关性分析发现,大部分指标之间存在显著相关性;再运用主成分分析,提取出两个主成分(特征值>1),计算各成分得分,通过建立综合得分模型排序和聚类分析得到,XJ1类别香精香料的综合品质较好,XJ3类别综合品质较差,其他样品综合品质居中。进一步对两大主成分因子分别进行品种的聚类分析,可按照不同需求选择样品。因此,本研究可以为之后不同香精香料品种的分析提供理论依据,为香精香料质量控制和综合评价奠定基础。

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