RP-HPLC法同时测定豆瓣酱中4种尼泊金酯的一测多评研究

刘超，景赞，余敏灵

(乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000)

尼泊金酯是一类高效、低毒且容易降解的防腐剂，具有化学稳定性高、不挥发、抗菌、成本低且无气味等优势。因具备羟基结构，其抗菌性和广谱性明显高于其他传统的添加剂。因其良好的抗菌效果，美国、日本等国家均已将尼泊金酯类物质列入食品防腐剂目录。现有的尼泊金酯的检测方法有气相色谱法、液相色谱法等，但以上方法均无法实现一种标准物质同时测定几种物质的要求。一测多评法是近年来药品领域为解决标准品购买困难、性质不稳定等问题而诞生的一种质量控制方法。这种方法利用待测的几种物质中的一种物质标准品实现其余物质的定量。徐赛华等利用一测多评法实现了重楼药材中4种皂苷类含量的测定；王欣等利用一测多评法实现了黄连须中5种生物碱含量的测定；于雪娥等利用一测多评法实现了淫羊藿中7种黄酮类成分含量的同时测定；刘峰等利用一测多评法实现了沙棘鲜果中槲皮素、山奈素、异鼠李素含量的测定。但是，一测多评法在食品中少有报道。甲醇等化学试剂对身体有害并会对环境造成污染，若长期且不当接触，会对身体造成较大的伤害。在试验过程中，尝试用乙醇代替甲醇作为提取试剂和流动相，在保证试验数据准确可靠的基础上，可以大大降低甲醇给检验员带来的伤害以及对环境的污染。

试验建立了RP-HPLC法同时测定豆瓣酱中4种尼泊金酯一测多评的检验方法，为一测多评法在食品中的应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

豆瓣酱：市售。

1.2 试剂

无水乙醇(色谱纯，CAS：64-17-5)、正己烷(色谱纯，CAS：110-54-3)：成都科隆化学品有限公司;对羟基苯甲酸甲酯(CAS：99-76-3)、对羟基苯甲酸乙酯(CAS：120-47-8)、对羟基苯甲酸丙酯(CAS：94-13-3)、对羟基苯甲酸丁酯(CAS：94-26-8)：Stanford Chemicals Company。

1.3 主要仪器与设备

DGU-20A型高效液相色谱仪 日本岛津公司；ME204T102型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TGL-16型台式高速离心机 四川蜀科仪器有限公司；KQ-700型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XH-C型旋涡混合器 江苏金怡仪器科技有限公司。

1.4 色谱条件

液相色谱柱：CAPCELL PAK C(4.6 mm×250 mm，5 μm)。进样体积：10 μL，流速：0.5 mL/min，柱温：35 ℃，流动相A为乙醇，流动相B为水。

表1 流动相梯度洗脱

1.5 标准曲线的配制

1.5.1 尼泊金酯类标准储备液

分别精确称取10 mg尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯标准品至4个10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，4种尼泊金酯类溶液浓度均为1 mg/mL。

1.5.2 尼泊金酯类混合标准工作溶液

分别准确吸取4种尼泊金酯类标准储备液0，10，20，40，60，80，100 μL置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，配制成浓度为0，1，2，4，6，8，10 μg/mL的尼泊金酯类混合标准工作溶液。

1.6 供试品溶液

称取混匀后的豆瓣酱试样5.0 g(精确至0.01 g)置于25 mL塑料离心管中，加入10 mL乙醇、10 mL正己烷，涡旋1 min，超声提取30 min，8000 r/min离心5 min，除去正己烷层，吸取乙醇层至25 mL容量瓶中，残渣中加入5 mL正己烷、10 mL乙醇重复提取1次，合并2次上清液，乙醇定容至25 mL，供上机分析。

2 结果与分析

2.1 流速的选择

由于含碳量高，乙醇的黏度较甲醇大。液相色谱流速越小，出峰越晚、峰形越宽、柱压越低；液相色谱流速越大，出峰越早、峰形越窄、柱压越高。试验考察了柱温为35 ℃，流速分别为0.3，0.5，0.7， 0.9 mL/min时峰形宽窄、出柱压、分离度等因素，综合选出最适流速。

由表2可知，流速除了在0.3 mL/min时峰形稍宽外，其余流速所对应的峰形均较窄，流速在0.7,0.9 mL/min时对应的柱压均较大，且在流动相梯度洗脱过程中，最高柱压分别达到15.6，18.3 MPa，对液相色谱柱不利。从分离度看，以上4种流速对应的分离度均满足要求。综上，试验选择最佳流速为0.5 mL/min。

表2 不同流速对应峰形、初始柱压及分离度情况

2.2 柱温的选择

柱温影响出峰时间、柱压高低、峰形宽窄等因素。柱温越高，出峰时间越早、柱压越低、峰形越窄；反之，出峰时间越晚、柱压越高、峰形越宽。试验考察了流速为0.5 mL/min，柱温分别为25，30，35，40 ℃时峰形宽窄、柱压、分离度等因素，综合选出最适柱温。

由表3可知，柱温对峰形的影响较小，在不同的温度下，峰形均较窄；温度对柱压的影响较大，当柱温为25，30 ℃时，对应的初始柱压及梯度洗脱中最高柱压均较大；柱温在35，40 ℃时，对应的初始柱压及最高柱压均较小。柱温的变化对分离度的影响较小，以上4种流速对应的分离度均满足要求。综上及考虑到经济性，试验选择最佳柱温为35 ℃。

表3 不同柱温对应峰形、初始柱压及分离度情况

续 表

2.3 f值和t值的确定

试验采用尼泊金甲酯为参考对象，以尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯标准曲线斜率与尼泊金甲酯标准曲线斜率的比值分别作为这3种化合物的校正因子值；以尼泊金甲酯保留时间为参考对象，以尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯保留时间与尼泊金甲酯保留时间的比值分别作为这3种化合物的相对保留时间t。

由表4可知，尼泊金甲酯回归方程为y=141742x+281.97，校正因子=123608/141742=0.8721，=124771/141742=0.8803，=100684/141742=0.7103；由校正因子得到尼泊金乙酯校正方程为y=141742+281.97，尼泊金丙酯校正方程为y=141742+281.97，尼泊金丁酯校正方程为y=141742+281.97；相对保留时间为t=1.0851，t=1.1982， t=1.3556。

表4 4种尼泊金酯类线性方程

2.4 校正因子f值耐受性考察

实际应用中，色谱条件的变化可能会引起值的变化，试验考察了不同进样体积、不同流速对值的影响，设置进样体积分别为8.0，10.0，12.0 μL；设置流速分别为0.4，0.5，0.6 mL/min，考察二者对值的影响，结果见表5。

表5 校正因子f值耐受性考察

由表5可知，色谱条件常见的变化因子进样量和流速的变化对校正因子值的影响极小，即校正因子值对可能影响的色谱条件的变化耐受性好。

2.5 方法检出限及定量限

称取混匀后的豆瓣酱试样5.00 g(精确至0.01 g)置于25 mL塑料离心管中，分别加入4种尼泊金酯类标准储备液各10 μL，其余按照1.6操作，采用S/N=3计算方法检出限、S/N=10计算方法定量限。

表6 4种尼泊金酯类检出限及定量限

2.6 方法准确度及精密度试验

图1 4种尼泊金酯类色谱图

称取18份混匀后的空白豆瓣酱试样5.00 g(精确至0.01 g)于25 mL塑料离心管中，每6份为一组，向每组中分别加入25，50，200 μL 4种尼泊金酯类标准储备液，其余按照1.6操作，配成浓度为5，10，40 μg/kg的尼泊金酯类低、中、高浓度试样。将上述18份溶液注入高效液相色谱仪，将峰面积代入尼泊金甲酯回归方程，尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯校正方程计算浓度，与实际加标浓度比较并计算RSD值，得4种尼泊金酯类准确度及精密度结果，见表7。

表7 不同浓度4种尼泊金酯类准确度及精密度结果(n=6)

续 表

由表7可知，采用尼泊金甲酯回归方程，尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯校正方程在5，10，40 μg/kg三水平下回收率、精密度依次为尼泊金甲酯85.4%～95.0%、2.7%～4.9%；尼泊金乙酯86.7%～95.0%、3.0%～3.7%；尼泊金丙酯85.2%～94.0%、2.7%～3.5%；尼泊金丁酯84.8%～96.1%、1.2%～3.7%。由此可知，在常规加标回收方式下，采用一测多评法计算4种尼泊金酯类物质回收率较高、精密度较好，能够满足试验要求。

2.7 供试品溶液及色谱柱稳定性试验

取1 μg/mL的尼泊金酯类低浓度试样，按照上述测定条件，分别在0，4，8，12，16，20，24 h进样，考察值变化情况，以RSD表示，用于供试品溶液稳定性试验；将所用的液相色谱柱在无水乙醇中保存，在第30，60，90，120，150，180天使用，考察理论塔板数，以RSD表示，考察柱效变化情况，用于色谱柱稳定性试验。结果表明，在24 h内=0.85%、=0.64%、=0.54%；在180 d内尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯理论塔板数变化依次为0.4%、0.3%、0.5%、0.3%。说明在24 h之内，样品溶液较为稳定；液相色谱柱在180 d之内变化均<1.0%，表明液相色谱柱用乙醇作为保存剂较稳定。

3 实际样品的测定

在市面上随机抽取10种豆瓣酱，按上述方法进行前处理、上机分析，用一测多评法测定这10种豆瓣酱中的尼泊金酯类，结果见表8。

表8 样品中4种尼泊金酯类测定结果

由表8可知，豆瓣酱中主要检出尼泊金丙酯和尼泊金丁酯，尼泊金甲酯和尼泊金乙酯均未检出，可能的原因是尼泊金甲酯和尼泊金乙酯疏水性较差，而尼泊金丙酯和尼泊金丁酯疏水性较好，适合油性的豆瓣酱；且尼泊金酯类的抑菌效果随着烷链增长而增强，故在含油脂较多的食品中常检出尼泊金丙酯和尼泊金丁酯。

4 结论

试验建立了以乙醇替代甲醇作为提取溶剂和流动相同时测定豆瓣酱中4种尼泊金酯类的一测多评法，乙醇代替甲醇可以降低甲醇对检验员身体的伤害，降低对环境的危害；以尼泊金甲酯为参考，建立了4种尼泊金酯类的定量模型，可以实现在缺少尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯标准品的情况下对这4种尼泊金酯类的准确测定。试验考察了乙醇作为流动相时，柱温及流速的选择，确定了校正因子值及相对保留时间t；进行了供试品溶液及色谱柱稳定性试验及方法学验证。试验表明，此方法简单、经济、环保，适用于豆瓣酱中4种尼泊金酯类物质的测定。