5种植物半胱氨酸蛋白酶在肉类加工中的研究进展

张琼，邹强，刘雨蝶

(成都大学 食品与生物工程学院，成都 610106)

酶，作为一种高效的生物催化剂，能够加快生化反应速率，在肉制品加工中具有不可替代的作用，肉制品加工中参与的酶种类众多，基本可分为水解酶、转移酶和氧化还原酶这3大类。半胱氨酸蛋白酶属于水解酶类中的一个子集。半胱氨酸蛋白酶在肉制品实际应用中多为植物半胱氨酸蛋白酶，相比于其他动物、微生物来源的半胱氨酸蛋白酶，具有安全、易获取、易保存、热稳定性强等优势。因此,早在20世纪末期，植物半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶就作为食品添加剂中的一员被广泛应用于肉制品加工中。随着科技的不断发展，其余的植物半胱氨酸蛋白酶(菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、猕猴桃蛋白酶、生姜蛋白酶)陆续被发现和应用，皆表现出良好的催化水解效果。不仅如此，这些植物半胱氨酸蛋白酶联合各种物理干预方式、化学试剂、其他酶类在肉制品的加工中应用范围越来越广，其价值也进一步得到提升。因此，我们汇集了近些年来的相关研究报道，认为有必要对以上内容做一次综述，突出其在肉品中的应用价值及潜力。

1 半胱氨酸蛋白酶的简介

半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)，也被称为硫醇蛋白酶，分子量约为21～30 kDa，其活性中心的催化位点上含有亲核的Cys残基，属于水解酶中的一大类。半胱氨酸蛋白酶能够催化水解多种类型的化学键，包括肽键、酰胺键、酯键、硫酯键等，作用底物选择面相对较广，总体上表现为广谱特异性。半胱氨酸蛋白酶从来源上分为植物半胱氨酸蛋白酶、动物半胱氨酸蛋白酶和微生物半胱氨酸蛋白酶。从剪切基团上又可进一步细分为外肽酶和内肽酶，两者对于蛋白底物切割位点的偏爱有明显的差异。例如：外肽酶偏向于切割靠近底物末端氨基或羧基的肽键，能够释放出具有特殊功能和风味的氨基酸。而内肽酶则偏向于切割远离N-或C-末端的肽键，能够生成短肽、部分功能性肽及氨基酸。

2 5种植物半胱氨酸蛋白酶的基本特性

在肉类加工中，常见的植物半胱氨酸蛋白酶主要包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、猕猴桃蛋白酶以及生姜蛋白酶，它们属于半胱氨酸家族中的内肽酶。分别从分子质量、来源、最适活性范围、活性基团、催化作用等方面对它们的基本特性进行了简单的概述，见表1和表2。

表1 5种植物半胱氨酸蛋白酶的基本理化特性

表2 5种植物半胱氨酸蛋白酶的基本催化特性

3 5种植物半胱氨酸蛋白酶在肉类加工中的应用

3.1 在肉类加工中的使用形式和引入方式

植物半胱氨酸蛋白酶在肉类加工中通常有两种使用形式：选用商业酶制剂或富含半胱氨酸蛋白酶的食品来提供所需的酶类。引入方式大多分为3种：注射、腌制、作为配方原料。商业酶制剂具有较高的活力和纯度，且使用方便，但成本相对较高。添加含有所需酶类的食品，如菠萝汁、生姜汁等，使用成本相对较低，但成分复杂，可能会影响加工肉制品的品质。以注射方式引入，肉品处理时间较短，但通常有肉眼可见的组织损伤。腌制则使时间成本显著增加，且易受其他不确定因素影响。作为配方原料使用时，对加工肉的形态及环境有相对较高的要求，因此在实际应用中常根据不同的加工方式和产品特性选择适宜的使用方法和引入方式，以获得理想的产品。

3.2 肉制品的嫩化

植物半胱氨酸蛋白酶能够在一定程度上破坏肌纤维和结缔组织的完整性，并在肌原纤维和胶原蛋白层面上实施降解，进而使肉品得到嫩化。Ha等[1]发现木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、猕猴桃蛋白酶以及生姜蛋白酶均能有效水解牛肉中的肌原纤维和胶原蛋白。Doneva等[2]设置了木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的不同浓度梯度和处理时间，结果表明，两者之间的主体效应显著影响了火鸡肉胶原蛋白的降解。Ramezani等[3]添加无花果蛋白酶到牛肉香肠中，观察到肉蛋白的溶解度增加。Aminlari等[4]研究发现，猕猴桃蛋白酶能够降解牛肉半腱肌中的肌浆和肌球蛋白，蛋白质溶解度增加，牛肉嫩度得到改善。Abdel-Naeem等[5]观察到在添加了0.05%木瓜蛋白酶和5%生姜汁的骆驼肉汉堡肉饼中，胶原蛋白溶解度明显增加，剪切力值降低。

3.3 制备功能性产品或调味料的原料

肉类制品在加工过程中通常会产生大量的废弃物和下脚料，同时市场上也存在许多低值的肉类，植物半胱氨酸蛋白酶则可以将这部分材料转化为具有高附加值的产品，提高其利用率和商业价值[6]。植物半胱氨酸蛋白酶能够降解肌肉中的大分子肉蛋白，生成多肽类物质，其中就含有部分功能性肽，可用于制作功能性产品[7]。同时肉蛋白的深度水解会释放出具有特殊功能和风味的酯、氨基酸等有机化合物，可用于制作调味料。孙晓东等[8]以红岛蛤蜊肉为作用对象，添加8000 U/g的木瓜蛋白酶，酶解4 h，制备出氨基态氮含量为0.430 g/mL的海鲜风味酶解液，可作为风味调料的原料。Tanuja等[9]添加木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶来制备蛋白水解物，获得的产物均显示出接近90%的自由基清除能力，可作为食品添加剂改善产品的功能及营养状况，将其转化为高端产品。Elavarasan等[10]使用菠萝蛋白酶水解淡水鲤鱼肉制备鱼蛋白水解产物，结果表明，其具有很高的清除DPPH自由基的活性，可作为功能性食品和保健品的原料。刘艳等[11]研究无花果蛋白酶酶解牡蛎肉，通过正交实验确定了牡蛎酶解液的最佳工艺参数，其所得的酶解液DPPH自由基和OH自由基清除率分别高达71.80%和16.19%，表现出较强的抗氧化活性，可用于抗氧化肽功能性产品的开发。

3.4 改善肉制品的风味

植物半胱氨酸蛋白酶作用于肉蛋白通常会产生游离氨基酸等影响肉制品风味的前体物质或中间产物，有利于加速肉制品风味的形成，同时对改善肉制品风味具有一定的效果[12-13]。肖夏等[14]在牛肉腌制过程中添加同等比例的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，不仅改善了牛肉的品质，而且牛肉中游离氨基酸、必需氨基酸以及与风味相关的氨基酸含量均明显上升。陈析等[15]采用0.3%的无花果蛋白酶作为腌制液，结果显示，在6～8 ℃条件下腌制6～8 h，牛肉获得最佳风味。玉素甫·苏来曼等[16]添加猕猴桃蛋白酶进行发酵，通过对马肉发酵香肠成品进行感官分析，发现猕猴桃蛋白酶赋予其特殊的风味和口感。卜宁霞等[17]使用姜汁嫩化鸡肉干，在最佳工艺参数下检测并分析出烃类、醇类、酮类、醛类、酯类共35种挥发性风味物质。

4 5种植物半胱氨酸蛋白酶在肉类加工中的发展趋势

随着人们生活质量的提高，消费者对肉类加工产品提出了越来越高的要求，促使外源酶的应用不仅需要突破在肉类加工过程中的局限性，而且更注重于对其内在潜力和应用空间的开发，因此部分研究人员倾向于将这5种植物半胱氨酸蛋白酶与各种物理干预方式或多种化学试剂结合，甚至与其他酶类形成复配酶来共同使用，增大其作用面，最大程度达到预期的品质效果。酶在肉块加工工艺中传统的引入方式有注射和腌制，但无论采用何种方法，始终都存在酶在肉块中均匀渗透及分布的问题。目前为止，滚揉、超声波是解决这一问题相对有效的方式。滚揉是一种机械力，可拉伸肌纤维，促使肌节变长，韧性降低，同时肌内膜、肌束膜等包裹和支撑肌肉、筋腱和神经的致密性结缔组织因受到外力冲击而出现松散破碎的现象。酶被注入肉块后，可随着滚揉的机械性动作渗透到肉块的各个部位，实现均匀分布。蒋小锋等[18]向大小为3 cm×3 cm×4 cm的马肉肉块中注射菠萝蛋白酶液，并结合滚揉处理，获得了马肉肉块整体的最佳嫩化参数。超声波是一种声能，其输出的能量可通过调控设定的功率和持续时间来实现。超声波在液态系统中会产生空化作用，可促进介质的搅动，具有强烈的传质效应。使用酶液静态腌制肉块时，酶基本上聚集在肉块的表面，没有外在的驱动力，很难进入到内部，因此肉块内部和表层品质差异较大，整体处理效果难以把控。采用超声波和半胱氨酸蛋白酶同步处理肉块，可将超声波作为一种推动力，促使酶均匀且快速地渗透到肉块内部。Barekat等[19]将牛肉腰最长肌部位分割为3 cm3的肉块，同时采用0.1%的木瓜蛋白酶溶液和频率为20 kHz的超声波同步处理30 min，处理后的样品由表及里人工切割为0.5 cm厚的牛肉切片，通过对比每层切片样品的总蛋白酶水解活性，在光学显微镜以及场外发射扫描电镜中观察到肌纤维结构变化，证明了超声波能够协助木瓜蛋白酶在肉块中的均匀渗透和分布。植物半胱氨酸蛋白酶与糖类化合物联用，对于肉的口感和风味有协同增效的作用。半胱氨酸蛋白酶降解肉蛋白形成了小肽、游离氨基酸、挥发性羰基化合物等多种小分子风味物质，这些风味物质易与肉制品中添加的糖类发生美拉德反应，进而生成新的风味化合物和呈味物质。刘劭等[20]为了得到更好的美拉德反应产物，确定了最佳反应条件：木瓜蛋白酶和D-木糖添加量分别为1.8 mg/g和3%，水解和美拉德反应时间分别为35 min和45 min，生成了大量类黑精的前体物质和中间产物。植物半胱氨酸蛋白酶与不同酶类之间具有协同作用，酶类复配可多位点水解肉蛋白，获得多样化水解产物，提升肉类加工过程中产生的边角料的利用率。就蛋白酶而言，不同种类的蛋白酶作用的蛋白底物也不尽相同。如:半胱氨酸蛋白酶类主要水解甘氨酸、赖氨酸和精氨酸等蛋白底物；金属蛋白酶类主要水解苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸等蛋白底物；丝氨酸蛋白酶类主要水解赖氨酸、精氨酸等蛋白底物。李园等[21]以牡蛎肉为原料，用双酶(无花果蛋白酶和风味蛋白酶)水解制备的酶解液具有较高的抗氧化性和蛋白质回收率，解决了单酶水解中水解度低的问题。

5 结语

随着技术的不断革新，以上5种植物半胱氨酸蛋白酶的潜力被陆续开发，在肉制品加工中的使用面和作用范围不断增加，将为我国肉类行业在降低成本、提高肉制品质量等方面取得更大的成就。但与此同时，不可忽略的是社会的发展也会带来消费者更多的诉求，促使肉类加工者考虑到更多的因素，肉类加工也将面临更多的难题。因此，未来这些植物半胱氨酸蛋白酶如何突破工业化应用上的各种限制来提高其实用性，最终创造收益将是一直存在的挑战。