南疆地区枣树叶缘褐斑病的病原鉴定

刘振亚，张 萍，訾莉莉，朱天生

（1.塔里木大学农学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学园艺与林学学院，新疆 阿拉尔 843300）

枣系鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Zizyphus Mill.）植物[1]，其对环境的适应能力强，主要表现在耐盐碱和耐干旱方面[2]。枣树的种植可以在一定程度上改善南疆地区的生态环境，对减少扬沙和浮沉天气起到一定作用[3]。同时，种植枣树的经济效益较高，嫁接后四年生的枣园年均收益可达1 万元/667m2。因此，种植枣树已经成为南疆农民增收的主要途径。但是近年来枣树叶缘褐斑病呈现逐渐加重的趋势，主要表现为下部叶片首先叶缘出现褐色斑点，病斑直径为2～4 mm，病斑常沿叶缘连在一起；果枝或枣吊顶生的2～3片新叶无症状，向下叶片症状逐渐加重，可在9 月引起叶片提前脱落，影响第2 年树势，进而影响产量。目前，关于枣树叶缘褐斑病的报道较少见，引发该病的致病菌种类也尚不明确，给其防治工作带来一定的困难。基于此，笔者从南疆地区枣树主要种植区采集典型的叶缘褐斑病的病叶，从病叶中分离获得病原菌，对其形态特征进行分析，并结合rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 多基因联合序列分析对其进行分子生物学鉴定，以期明确南疆地区枣树叶缘褐斑病的病原菌种类，进而为防治此类病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从新疆阿克苏、喀什、和田等主要枣树种植区采集病叶，进行分离培养。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与培养采用常规组织分离法对病原菌进行分离与纯化[4]。将分离物置于25℃培养箱中培养，并进行2～3 次纯化[5]，最后以单孢纯化保存备用。

1.2.2 致病性测定将在PDA 上培养10 d 的病原菌，用无菌水制成孢子悬浮液，置于10×40 倍显微镜下镜检，每个视野悬浮液中分生孢子量为20～40 个。选择健康的枣叶，采用有伤方式接种病原菌孢子悬浮液，每个处理10 片，重复3 次。具体做法是用清水清洗枣叶，再用75%酒精表面消毒，最后用无菌水冲洗2～3 次，晾干，用灭过菌的接种针刺伤枣叶，将孢子悬浮液喷雾接种到有伤的枣叶上，以无菌水作为对照，然后放入事先铺有湿润滤纸的搪瓷盆中，在25℃培养箱中按12 h/12 h 光暗交替培养，接种后观察发病情况，统计发病率[6-7]。将接种后发病的枣叶进行病原物的再次分离，通过培养外观及显微镜等观察病原物的特征，确定分离得到的病菌为同一病原菌。

1.2.3 病原菌的鉴定（1）形态学鉴定。将病原菌接种到PCA 培养基上置于25℃培养箱中，12 h/12 h 黑暗交替培养5 d 后，观察分生孢子的形态特征，并在在徕卡荧光数码显微镜下观察病原菌的产孢表型[8-9]。根据分生孢子、分生孢子梗和产孢表型等特征，对照《中国真菌志 第十六卷 链格孢属》[10]中的记录初步确定病原菌的属种。（2）分子生物学鉴定。参照刘振亚等[2]的研究方法获取菌丝体，将菌丝体在40℃烘干后，放入灭菌EP 管中备用。采用CTAB 法提取菌丝基因组DNA[11-12]。病原菌rDNA-ITS 扩增采用ITS1 和ITS4 引物，EF-1α基因扩增采用EF1-728F和EF1-986R 引物；β-tubulin基因扩增采用Beta-F 和Beta-R[12-13]引物，引物序列见表1，扩增体系和扩增程序参考唐淬[14]和臧睿[15]的方法。将扩增产物送到华大基因科技有限公司进行测序。获得序列后，登陆NCBI 网站，下载链格孢属不同种的序列和相似序列，使用MEGA6. 06 软件建立系统发育树，用Bootstrap对系统树进行检验，设置1 000 次重复。

表1 PCR 所需引物及其序列

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果

用常规组织分离法，从病叶上分离纯化出2 种真菌分离物，分别编号为HTYT-1 和HTYT-2。

2.2 致病性测定结果

将HTYT-1和HTYT-2接种到枣叶上，如图1所示，HTYT-2 菌种刺伤接种7 d 后，叶片上刺伤处可见褐斑，15 d 后刺伤接种的叶片发病率达到73%（图1），其发病症状与田间自然发病的症状一致，而HTYT-1 刺伤接种以及对照处理均未见发病症状。从发病的叶片病健交界处取叶片组织再次分离微生物[16]，获得了与原分离菌株一致的病原菌。依据柯赫氏法则，可以确定HTYT-2 为枣树叶缘褐斑病的致病菌。

图1 枣树叶缘褐斑病的发病症状

2.3 病原菌的形态学鉴定结果

将HTYT-2 接种在PCA 平板上，于25℃在近紫外灯和日光灯下12 h/12 h 光暗交替培养5 d，菌落初期为白色，后期逐渐变深为绿色与褐色相间，边缘灰白色，圆形、边缘整齐。在PCA+滤纸上培养5 d 后，观察发现其分生孢子为棒状（图2），孢子基部钝圆，具横纵隔2～5 个，分隔处略缢缩；孢身大小为（15.49～45.73）×（7.48～17.36） μm，平均27.49×12.03 μm；喙呈短柱状，大小为（0～14.68）×（0～6.02） μm，平均4.56×3.76 μm；分生孢子梗略弯曲、分枝，大小为（11.82～47.62）×（3.49～4.73） μm，平均4.25×26.31 μm。根据病原菌的形态特征，参照《中国真菌志 第十六卷 链格孢属》中的记载，初步鉴定该病原菌为链格孢属链格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissler]。

图2 病原菌HTYT-2 的形态特征

2.4 病原菌的分子生物学鉴定结果

2.4.1 单基因的分子系统学分析获得序列后，登陆NCBI 网站，下载链格孢属不同种的序列和相似序列，用MEGA6. 06 软件中的 Neighbour-joining 方法生成NJ 系统发育树进行分析。基于ITS 序列构建的系统发育树（图3）显示，HTYT-2 与A.solani、A.alternata、A.gaisen、A.tenuissima、A. brassicae聚在一个大的分枝下，其相似率为64%，因此仅通过ITS 序列不能将HTYT-2 鉴定到具体的种。基于EF-1α 序列构建的系统发育树（图4）显示，HTYT-2 与A.alternata（KJ008710、KF644357、KJ638247、KJ008705、KF644357、AY438647S1）聚为一组，其相似率为64%。基于β-tubulin 序列构建的系统发育树（图5）显 示，HTYT-2 与A.alternata（KJ008681、KJ008682、KF680871）聚在一起，其相似率为90%。根据EF-1α序列和β-tubulin 序列建立的系统发育树分析结果，将HTYT-2 鉴定为链格孢属链格孢A.alternata。

图3 基于ITS 序列构建的系统发育树

图4 基于EF-1α 序列构建的系统发育树

图5 基于β-tubulin 序列构建的系统发育树

2.4.2 多基因序列的分子系统学分析使用Sequence Matrix 将ITS、EF-1α、β-tubulin 序列按前后顺序串联，利用PAUP4b10 软件，采用uncorrected（"p"）核苷酸取代模型，以Plespora herbarum为外群，建立多基因的Neighbor-joining （NJ）系统发育树对病原菌进行分子系统学分析。由图6 可知，菌株HTYT-2 与不同登录号的A.alternata（KU324782、KX783388、KX783397）聚在一个分支，说明菌株HTYT-2 与A.alternata的亲缘关系最近，由此可以确定菌株HTYT-2 的种类为A.alternata。

图6 基于ITS、EF-1α、β-tubulin 多序列构建的系统发育树

3 结论与讨论

该研究从南疆枣树主要种植区采集典型的叶缘褐斑病的病叶，从中分离纯化获得HTYT-1 和HTYT-2这2 种菌株，经过柯赫氏法则验证，明确HTYT-2 菌株为枣树叶缘褐斑病的致病菌。经形态特征和多基因序列联合分析，确定该菌株为链格孢菌[Alternaria alternata（Fr.）Keissler]。

在实验室条件下培养的链格孢属种级分生孢子形态特征有较大的变化，同属不同种的分生孢子形态特征在一定培养条件下具有趋同现象[8]，给准确鉴定到种以及小孢子种带来了较大的困难[17]，而采用分子生物学方法结合形态学鉴定可以解决这一问题[18]。但单靠ITS 序列不能提供足够的信息位点来分析属以下某些种间的差异[19]，有时基于ITS 序列建立的系统发育树并不准确，甚至可能得出错误的种类鉴定结果[20]，因此仅仅通过ITS 序列无法准确鉴定菌株的种类。而多基因联合序列分析具有选择基因数量存在灵活性、结果准确、适用物种范围广等优点[21]，被广泛应于链格孢属的种别鉴定。罗欢等[22]使用rDNA-ITS、EF-1α、GAPDH 多基因序列分析将波斯菊叶枯病新病原菌确定为侵染向日葵链格孢A. helianthiinficiens；李番等[23]利用ITS 和β-tubulin 序列建立联合系统发育树，将石竹叶斑病病原鉴定为石竹链格孢A.nobilis。因此，利用形态学鉴定，并结合多基因联合序列[24-25]建立系统发育树，可提高对链格孢属种别鉴定的准确性，并明确病原菌的分类地位，从而为防治枣树叶缘褐斑病提供了理论依据。