染色体核型分析联合CNV-Seq检测在高龄孕妇产前诊断中的临床应用

唐艳，卢守莲，王珏

南京医科大学第一附属医院产科产前诊断中心，江苏南京 210029

高龄孕妇是指预产期年龄≥35岁的孕妇，随着三胎政策的提出，高龄孕妇不断增多。高龄孕妇是染色体异常的高危人群[1],染色体的异常可引起胎儿组织、器官发育异常等。多年来传统的产前诊断技术染色体核型分析一直作为诊断染色体畸变的金标准，能够直观地检测出染色体数目异常、大片段的缺失重复及平衡易位等。但是染色体核型分析存在许多缺点如培养周期长耗时耗力，通常只能检测5 Mb以上的异常[2]。近年来，随着分子检测技术的发展，高通量测序技术的出现为染色体畸变及染色体拷贝数变异检测提供了新的手段。本研究回顾性分析2018年1月—2020年1月南京医科大学第一附属医院368例高龄孕妇产前诊断羊水的染色体核型结果及基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)结果，探讨二者联合检测在高龄孕妇中的临床应用价值，为临床医生提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在本院进行产前诊断的高龄孕妇共368例，年龄35～48岁，孕周18～23周。通过羊膜腔穿刺术获取羊水标本，并在临床上进行胎儿染色体核型、CNV-Seq检测与分析。

1.2 方法

1.2.1 样本采集孕妇术前排空膀胱，取平卧位，经B超检测，基于无菌环境下，使羊水专用穿刺针经腹部穿刺，抽取30 mL羊水，其中的20 mL羊水实施细胞培养，以获得染色体核型，其余的10 mL实现CNV-Seq检测。

1.2.2 染色体核型分析 完成20 mL的羊水抽取工作后离心，离心时间为8 min，离心速度2 500 r/min，去上清液且将下层羊水细胞留下，并放在两个培养瓶中接种。孕妇的每个样本都需要实现双线培养。培养6 d后换液，换液后继续培养3～5 d后观察细胞生长状态，根据细胞生长状况进行收获，常规制片、G显带，显微镜下计数30个中期分裂相，两线镜下各分析5个核型，如果遇到嵌合体，加倍计数分析，染色体图像分析系统两线采集保存3张图片，核型结果参照《人类细胞遗传学国际命名体制ISCN2013》进行描述。

1.2.3 CNV-Seq检测 完成10 mL羊水抽取工作后，贝瑞和康公司完成CNV-Seq的样本分析。在实际检测中，主要针对的对象为染色体非整倍体变异、100 kb以上的CNV，具体方法为：提取待测样本DNA；采用科诺安试剂盒进行PCR-free建库；利用NextSeqCN500对建库后的样本进行测序；对测序的结果（fastq文件）进行质控，质控合格的样本用于全基因组范围上的CNV检测；将检测获得的开放阅读框（reads）与hg19参考基因组进行比对，按照基因组予以区间（bin）的划分，对每个bin上的唯一数目进行比对，对阴性对照在区域内的唯一比对数值进行计算，后期还需要使用GDSW算法对染色体异常或CNV详细分析。结果分为五类：致病、可能致病、临床意义未明、可能良性、良性。

如果发现结果异常的孕妇，可以通过电话随访的方式追踪，详细记录孕妇的妊娠结局和新生儿的健康情况。

1.3 统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据处理，计量资料使用（±s）表示，不符合正态分布的计量资料采用中位数（最小值～最大值）表示，采用t检验；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体核型分析结果

经过368例高龄孕妇的染色体核型检测，发现有异常者为30例，染色体异常检出率为8.2%（30/368），其中21三体7例，18三体2例，性染色体数目异常8例，嵌合体4例，染色体平衡变异6例，不平衡易位变异3例。

2.2 CNV-Seq检测结果

CNV-Seq结果异常40例，异常检出率10.9%（40/368），其中21三体7例，18三体2例，性染色体数目异常8例，嵌合体4例，≥10 Mb大片段缺失重复3例，＜10 Mb且 致 病 性CNVs3例，可 能 致 病 性CNVs3例，临床意义未明CNVs10例。

2.3 染色体核型分析联合CNV-Seq检测

染色体核型检测与CNV-Seq两种方法对于染色体非整倍体异常检出一致。而两种方法对于4例嵌合体的检出结果，差异有统计学意义（P＜0.05）。对于染色体核型分析检出的3例不平衡变异，CNV-Seq也检测出异常并且准确地检出染色体异常的位点。见表1。此外，染色体核型分析检出6例CNV-Seq未检出的染色体平衡变异。见表2。CNV-Seq检测出染色体核型未检出的3例致病性CNVs，3例可能致病性CNVs，以及10例临床意义未明的CNVs。见表3。

表1 应用不同检测方法染色体核型结果对比

表2 不同染色体核型检出的染色体平衡变异情况对比

表3 不同染色体核型致病性对比

续表3

对所有CNV结果异常的高龄孕妇进行电话随访。7例21三体综合征均选择终止妊娠，2例18三体均终止妊娠，8例性染色体异常中，1例超雌综合征的孕妇33周早产，未见明显异常，5例克氏综合选择终止妊娠，另外2例超雄综合征孕妇足月分娩目前新生儿未见明显异常。4例嵌合体中1例嵌合型21三体综合征与2例嵌合型特纳综合征选择终止妊娠，另外1例嵌合型特纳综合征失访。3例致病性CNV均引产，3例可能致病CNV选择继续妊娠，出生后胎儿未见异常。10例临床意义未明病例，其中5例做了父母CNV验证，证实临床意义不明片段来源于父母，随访7例足月分娩未见明显异常，其余3例失访。

3 讨论

拷贝数变异（copynumbervaria-tion，CNVs）在人类基因组中存在广泛，在1 000 bp上范围内会发生缺失、插入、重复等多位点的复杂变异，一般是染色体亚显微水平缺失或者重复，该情况的发生多是因为基因组重排导致的[3]。CNV-Seq主要是对CNV进行检测，在全基因组范围内完成，能够对DNA进行全基因组低深度高通量测序，也能进行CNV的检测，期间使用的方法为短序列比对、counts计算统计方法。

CNV-Seq多应用在果蝇的染色体CNV检测、肿瘤基因组检测中[4-5],后期开始检测人类遗传病有关的CNV。

本研究回顾性分析了368例高龄孕妇产前诊断的结果，共检出30例异常，检出率8.2%（30/368），其中21三体7例，18三体2例，性染色体数目异常8例，嵌合体4例，染色体平衡变异6例，不平衡易位变异3例。CNV-Seq检测出异常40例，检出率10.9%（40/368）。其中除了染色体核型结果6例平衡易位未检出，其他24例致病性改变CNV-Seq均检测出。此外CNV-Seq还额外检测出3例CNV≤10 Mb明确致病性样本，3例可能致病性样本，占比1.6%（6/368），10例临床意义不明样本。3例CNV可能致病性病例均进行父母染色体CNV验证，其中1例为母源性，另外2例为新发突变，3例病例孕妇均选择继续妊娠，出生后未见明显异常。10例临床意义未明病例中有5例选择夫妻双方CNV验证，证实异常片段均来源于父母，另外5例未做验证。10例病例3例失访，其余7例出生后均未见明显异常。

本研究中选取的均为高龄孕妇，即预产期年龄≥35岁的孕妇，368例高龄孕妇中染色体异常CNVSeq检出率高于染色体核型检测检出率，由此可见CNV-Seq在高龄孕妇的产前诊断中具有重要的临床意义。经过大量数据研究分析，产前诊断指征为高龄、血清学筛查提示染色体异常高风险或者因焦虑自愿选择产前诊断的孕妇中，当染色体核型分析正常时，采用分子检测手段还能发现额外1.0%～1.7%的具有临床意义的CNV异常[6-7]。Wang J等[8]开展了3 429例产前诊断样本前瞻性研究，其中包括高龄孕妇，研究提出CNV-Seq可作为产前诊断的一线检测手段。吴晓霞等[9]通过高龄孕妇人群中CNV发生率研究，发现具有临床意义的CNV发生率为1.9%。本研究染色体核型异常的孕妇中额外检测出1.6%的具有临床意义的CNV。

CNV-Seq用于产前诊断对比染色体核型分析，该方法需要的样本少，且分析速度快、准确，具备较高的分辨率，能实现染色体微缺失、微重复检测等优势。本研究中对于染色体核型正常的孕妇CNVSeq检测额外检测出6例具有临床意义的CNV,并且对于大片段的染色体重复缺失，染色体核型虽然也能检测出异常，但是由于染色体核型分析制片过程中受多种因素影响，有时显带并不是很理想，或者分辨率低无法准确地定位染色体断裂的位点，CNV-Seq可准确地定位到染色体断裂的位点[10-12]。染色体核型相比较CNV-Seq也有独特的优势，可直观观察全染色体组形态，检测染色体结构变异，可从形态学上解释染色体异常机理。本研究中染色体核型分析准确地诊断出6例CNV-Seq无法检测出的染色体平衡易位。因此，防止漏检，高龄孕妇在行产前诊断羊水染色体核型检测时可联合CNVSeq检测，提高染色体异常检出率。CNV-Seq由于是全基因组随机测序，测序位点没有偏向，会增加更多的拷贝数变异[13-15]，能够有效发现新基因，但工作量较大，临床医生可在羊膜腔穿刺前向孕妇交代清楚，由孕妇知情选择。