UPLC-MS/MS法快速测定马桑蚕蛹中3种马桑内酯

马桑蚕（Coriaria sinicasilkworm）又名蓖麻蚕，以马桑叶为食，故称之为马桑蚕[1]。马桑（Coriaria sinicaMaxim.）是马桑属植物，全株有毒，果实毒性最大，因外形与桑葚相似，易被误食而引发中毒[2]。马桑毒性成分有羟基马桑内酯（Tutin）、马桑宁内酯（Corianin）、马桑亭内酯（Coriatin）等二环倍半萜内酯毒素[3]。马桑中毒能引起痉挛、呕吐等一系列中毒症状，严重者可致死亡[4]。

目前，有关马桑毒素的研究主要集中在药理方面，如杀虫抑菌等方面[7-8]。含量测定相关报道较少，相关研究主要是对人体血液、尿液及蜂蜜中马桑内酯进行含量测定[9-11]。针对马桑蚕蛹中马桑内酯的检测方法尚未见报道。

本研究以马桑蚕蛹为研究对象，建立了马桑蚕蛹中3种马桑内酯的超高效液相色谱-串联质谱仪的分析方法。该方法简单快速，准确度和精密度高，可以为马桑蚕蛹进行深加工的质量安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马桑宁内酯、马桑亭内酯、羟基马桑内酯（纯度＞98 %）：云南西力生物技术股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）：上海安普实验科技股份有限公司；Oasis PRiME HLB（3cc/150 mg）柱：美国waters公司；实验室所用水均为超纯水。

超高效液相色谱仪（Agilent 1290）、三重四极杆质谱仪（Agilent G6470，配有电喷雾离子源）：美国Agilent公司；刀式研磨粉碎仪（GM200）：德国Retsch公司；超纯水机（Milli-Q）：美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取试样5.00 g，加入20 mL乙腈，超声提取10 min，4 500 r·min-1离心5 min，取上清液过PRiME HLB柱，弃去前几滴流出液，收集后续流出液，准确移取2 mL滤液于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL10%乙腈溶液溶解，过膜，供仪器测定。

1.2.2 标准溶液配制

标准储备液：称取5 mg（精确至0.1 mg）3种马桑内酯标准物质，用甲醇溶解并定容至刻度，浓度为1 mg·mL-1的单标储备液，-18 ℃避光保存。

基质混合标准溶液：用基质溶液配制浓度为10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1、200.0 μg·L-1以及500.0 μg·L-1的混合标准工作液。

由表2可以看出，使用FLAC3D模拟出的结果误差最大，单一Elman网络精度较高，但结合小波-模糊控制Elman网络的方法精度较单一Elman和FLAC3D，有了显著的提高，由图11可看出，小波-模糊控制Elman网络与拱顶位移变化曲线具有较高的贴合度，并减少了突变点的产生，较前两种方法，精度有了较大的提高。

1.2.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）：美国Agilent公司；柱温为40 ℃；进样体积为10.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 洗脱梯度表

（2）质谱条件。ESI源；负离子模式；多反应监测（Multiple Reaction Monitoring MRM）；毛细管电压为-3.5 kV；雾化器压力为40 psi；干燥气流速为10 L·min-1；鞘气流速为10 L·min-1；鞘气温度为300 ℃；目标物质谱条件见表2。

表2 质谱参数表

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法优化

2.1.1 提取

（1）提取溶剂。研究对提取溶剂的种类进行了考察，选取不同提取溶剂（乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯、0.1%甲酸-乙酸乙酯、甲醇及0.1%甲酸甲醇）对目标物进行提取，结果以回收率表示。结果表明，几种提取溶剂的提取效率差别明显，乙腈提取率为70%～79%，0.1%甲酸-乙腈提取率为65%～72%，乙酸乙酯提取率为42%～55%，0.1%甲酸-乙酸乙酯提取率为41%～50%，甲醇提取率为40%～48%，0.1%甲酸甲醇提取率为40%～45%。其中，乙腈提取率最高。进一步比较了不同浓度乙腈的提取效果（见图1），图中不同字母表示平均回收率差异显著（P＜0.05）。随着乙腈浓度的增加，提取率明显增大（P＜0.05）。故选用100%乙腈作为提取液。

图1 乙腈体积分数对目标物回收率的影响图（n=3）

图2 超声提取时间的回收率图

2.1.2 净化

蚕蛹中含有丰富的蛋白质、脂肪、磷脂等物质，实验过程中需对这些物质进行去除，最大程度降低杂质对实验结果的影响。实验考察了C18、PSA、PRiME HLB及Oasis HLB不同净化方法对目标物的净化效果。结果如图3所示，使用C18吸附剂净化时，羟基马桑内酯和马桑宁内酯损失较多，回收率均低于40%；使用Oasis HLB固相萃取柱净化时，马桑亭内酯和损失较多，回收率较差；使用PSA吸附剂的回收率为65%～69%，PRiME HLB小柱回收率为76%～86%，优于其他3种（P＜0.05）。故实验选取PRiME HLB小柱。

图3 不同净化方法的回收率图

2.2 仪器条件优化结果

2.2.1 色谱条件的优化

实验发现使用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，并采用梯度洗脱程序对目标物有较好的分离度。考察了不同有机相（甲醇、乙腈）和水相（纯水和0.1%甲酸溶液）组合的分离效果。结果发现，使用甲醇作为流动相时目标物的响应较好，但马桑宁内酯和马桑亭内酯色谱峰重叠；使用乙腈作为流动相时马桑宁内酯和马桑亭内酯有较好的分离，且水相中加入0.1%甲酸使目标物的响应较好。因此，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，目标物保留时间见表1，图4为不同流动相的总离子流图。

图4 不同流动相的总离子流图

2.2.2 质谱条件的优化

参考已有研究[8-9]配制200 ng·mL-1的3种马桑内酯混标溶液，在负离子模式下一级全扫描得到母离子，在最优碎裂电压下进行碰撞解离，通过子离子扫描得到定量和定性离子碎片离子信息，优化碰撞能量，并对其他质谱参数进行优化，如毛细管电压、干燥和鞘气的温度及流速等，优化结果见表2。

2.3 基质效应

基质效应计算公式：ME=[（基质匹配标准溶液曲线斜率/无基质标准溶液曲线斜率）-1]×100%。通常，|ME|≤20%时，基质干扰程度较低；|ME|在20%～50%时，为中等程度的基质干扰效应；|ME|≥50%时，表示基质干扰强烈[10]。结果见表3，3种马桑内酯的均存在基质抑制效应，在检测过程中采取基质溶液配制标准工作液的方法来降低基质效应干扰。

2.4 方法回归方程

用基质液配制系列标准工作液，以各组分的峰面积对质量浓度绘制标准工作曲线。结果表明，目标物线性关系良好，相关系数（r）均＞0.992。通过信噪比（S/N=3）计算检出限（LOD），结果见表3。

表3 回归方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应表

2.5 回收率和精密度

分别添加低、中、高3个浓度的标准溶液，每个水平做6个平行，结果见表4。3种马桑内酯的平均回收率在76.6 %～94.1 %，RSD在3.6%～12.6%。

表4 加标回收率和精密度表（n=6）

2.6 样品测定

使用本研究建立的方法对马桑蚕蛹及其粪便进行测定，结果马桑蚕蛹中均未检出3种马桑内酯化合物。通过对马桑蚕蛹的粪便进行测定，发现粪便中3种马桑内酯均有检出。

3 结论

建立了马桑蚕蛹中羟基马桑内酯、马桑宁内酯和马桑亭内酯的UHPLC-MS/MS快速分析方法。结果显示3种马桑内酯相关系数均＞0.992，平均加标回收率为76.6%～94.1%，相对标准偏差为3.6%～12.6%（n=6）。利用建立的方法对马桑蚕蛹及其粪便进行测定，结果发现，马桑蚕蛹中均未检出，在其粪便中3种马桑内酯均有检出。说明在马桑蚕蛹在消化马桑叶的过程中，并未吸收马桑叶中的马桑内脂，而是将其通过粪便排出体外。因此，加强马桑内脂在蚕蛹体内代谢途径和机理的进一步深入研究，为马桑蚕蛹综合利用及产品开发提供科学依据和技术支撑。