褪黑激素埋植剂对配种准备期水貂卵巢形态学和卵泡发育的影响

晏子越，彭 弟，吴占运，高 惠，胡良臣，马泽芳*，崔 凯*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.鄄城县畜牧服务中心，山东菏泽 274600；3.胶州市九龙街道办事处农业办，山东青岛 266300）

水貂（）属哺乳纲（Mammalia）、食肉目（Carnivoraes）、鼬科（Mustelidae）、鼬属（），生殖特性明显受季节性变化影响，主要与光周期调节松果体合成和分泌褪黑激素（Melatonin，MLT）的节律有关。有研究表明，对长日照动物家猫、马、狐等外源注入MLT，其生殖活动受到抑制，对短日照动物绵羊、山羊、鹿等外源注入MLT 后生殖活动显著增强，表明外源MLT 可抑制长日照动物、促进短日照动物的生殖活动。然而外源MLT 对短日照动物—水貂生殖活动影响的报道较少，仅见宋兴超等对公貂埋植120 d MLT 后发现，公貂睾丸重量显著增加；邵丽晓等对间情期母貂埋植MLT 发现，处于第IV 阶段的卵泡比I、II、III 阶段出现较多的闭锁卵泡。综上研究表明，外源MLT 可提高公貂睾丸重量，影响间情期母貂闭锁卵泡数量，但有关MLT 对配种准备期母貂生殖活动影响的研究尚未见报道。因此，本实验对比埋植MLT 172 d 和未埋植MLT 配种准备期水貂的卵巢，探讨MLT 对水貂卵巢形态学和卵泡发育的影响，为MLT 埋植剂应用于水貂生产实践和指导埋植MLT 埋植剂的水貂应用于繁殖提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计及饲养管理 于山东省诸城市（119°E，35°N）某水貂养殖场随机选取3 月龄健康、体重均匀（870±5）g 的白色水貂母貂200 只，随机平均分为埋植组和对照组，每组100 个重复，每个重复1 只。试验于2020 年7 月7 日—2020 年12 月26 日进行，共172 d。于试验开始当天对埋植组水貂颈部皮下埋植1 粒MLT埋植剂（含MLT 18 mg/粒），对照组不作任何处理；于试验结束当天随机选取埋植组和对照组水貂各3 只，采集卵巢样本，进行形态学和卵泡发育的观察与测定。

水貂饲养于南北走向、东西通风的棚舍内，采用单笼饲养，棚舍与笼箱均保持清洁干净，专人管理，定时饲喂，日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（按干物质计算）

1.2 卵巢的采集及处理 在实验结束当天，选取2 组水貂各3 只，CO窒息法处死后立即剖腹取卵巢，置于含有生理盐水的培养皿中，共计12 枚，于10 min 内完成培养皿内卵巢形态学观察和记录可视卵泡数量。用游标卡尺（200 nm）测量卵巢长、宽、厚，并计算体积；用电子天平（1/10 000）称量卵巢重量；将每只水貂右侧卵巢置于含有10%甲醛溶液的15 mL 离心管内，做好标记，运回实验室，室温条件保存48 h 以上，待组织切片备用。

1.3 卵巢组织切片的制作及观察 将固定48 h 后的卵巢用水稍加清洗后进行修块，然后依次按酒精梯度（50%、70%、80%、95%、100%）进行脱水，利用二甲苯溶液进行透明，并放入已溶的石蜡内于恒温箱（DH-250 型）浸蜡，做成保有卵巢组织的蜡块，将其切成四周留约2 mm 的方形或长方形蜡块，然后使用手摇式组织切片机（RM2235，Leica）将石蜡块切为厚约5 μm 的蜡片，每连续7 张取1 张蜡片，每个卵巢组织取6 张，共计36 张，做好标记，苏木素-伊红染色后，用BK5000 光学显微镜分别在4×学显倍、10 显微镜倍、20 显微0 倍和40×10 倍下观察成熟卵泡、三级卵泡、次级卵泡和初级卵泡及原始卵泡的形态，用目镜测微尺测量各级卵泡的直径、卵母细胞直径和透明带厚度，用计数器统计单位面积（1 000 μm）内各级卵泡数量。

1.4 统计分析 运用Excel 处理数据，利用SPSS 20.0软件中的独立样本检验进行比较，结果用平均值±标准误表示，＞0.05 代表差异不显著，＜0.05 代表差异显著，＜0.01 代表差异极显著。

2 结果

2.1 卵巢形态学和可视卵泡数量测定结果 由表2 可知，埋植组卵巢仅宽度与对照组没有差异，长、厚、体积、重量均大于对照组（＜0.01），可视卵泡数量多于对照组（＜0.05）。说明MLT 埋植剂埋植172 d 可促进卵巢长、厚、体积和重量的增加及可视卵泡数量的增多，对宽度没有影响。

表2 卵巢形态学和可视卵泡数量测定结果（n=3）

2.2 各级卵泡和卵母细胞数量、直径及透明带厚度测定结果 本试验共计比较了30 个原始卵泡，30 个初级卵泡，15 个次级卵泡，3 个三级卵泡和3 个成熟卵泡，2组各级卵泡形态见图1、图2，对两组各级卵泡相关指标进行测量分析得表3。由表3 可知，与对照组相比，埋植组原始卵泡和初级卵泡数量均增多（＜0.01），次级卵泡数量差异不显著，埋植组有发育完好的三级卵泡和成熟卵泡，对照组无三级卵泡和成熟卵泡；从原始卵泡到初级卵泡，初级卵泡到次级卵泡的生长速度2 组分别为1.7～2.0、3.3～3.5 倍，埋植组从次级卵泡到三级卵泡，三级卵泡到成熟卵泡的生长速度分别为1.7、2.7倍；从原始卵母细胞到初级卵母细胞，初级卵母细胞到次级卵母细胞2 组生长速度分别为1.0～1.2、1.7～1.8 倍，埋植组从次级卵母细胞到三级卵母细胞，三级卵母细胞到成熟卵母细胞的生长速度分别为1.4、1.1 倍；2 组均在次级卵泡阶段开始出现透明带，埋植组透明带厚度从次级卵泡到三级卵泡，三级卵泡到成熟卵泡的生长速度分别为1.6、1.3 倍。说明MLT 埋植剂埋植172 d 可促进原始卵泡和初级卵泡数量的增多及有腔卵泡的提前发育，而对次级卵泡数量及腔前卵泡的直径、卵母细胞直径和透明带厚度没有影响。

表3 各级卵泡和卵母细胞数量、直径及透明带厚度测定结果

图1 对照组各级卵泡形态

图2 埋植组各级卵泡形态

3 讨 论

3.1 MLT 埋植剂对卵巢形态和可视卵泡数量的影响 水貂繁殖规律明显受季节性变化影响。本实验通过埋植MLT 埋植剂结果显示，埋植组卵巢长、厚、体积和重量较对照组显著增加，可视卵泡数量显著增多，而卵巢宽度无显著变化，与MLT 能促进短日照动物绵羊、鹿等动物生殖活动的结果一致，表明MLT 埋植剂亦可促进水貂卵巢发育。这与水貂的繁殖规律和外界光照长度变化调控自身MLT 分泌模式有关，外界光照信号作用于视网膜产生神经冲动，经过复杂的神经传导到达颈上神经节（SCG），由SCG 将交感信息传给松果体，松果体作为神经-内分泌转换器将神经输入信号转化为内分泌信息输出，根据外界光照信息的变化调节去甲肾上腺素（ME）的分泌量，进一步调节MLT 的合成与分泌，从而昼夜长短的变化引起MLT 分泌节律的变化。

本实验埋植MLT 埋植剂相当于代替光周期变化直接改变动物机体MLT 的分泌量，其可穿过所有细胞的细胞膜进入所有组织，通过直接和间接两种作用方式影响生殖系统的变化，一方面直接作用于卵巢上MLT 的结合位点，另一方面间接作用于下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，从而促进卵巢发育。而本实验中埋植组与对照组的卵巢宽度差异不显著，可能与卵巢自身结构发育规律有关，其机理有待进一步研究。

3.2 MLT 埋植剂对各级卵泡数量、直径、卵母细胞直径和透明带厚度的影响 本实验中2 组原始卵泡到初级卵泡再到次级卵泡，原始卵母细胞到初级卵母细胞再到次级卵母细胞的的生长速度均一致，说明MLT 埋植剂对卵泡和卵母细胞的发育速度没有影响。卵泡发育速度在初级卵泡到次级卵泡阶段发育较快，这是由于颗粒细胞的快速增殖引起的，卵母细胞从初级阶段到次级阶段发育较快，到三级和成熟阶段逐渐缓慢，其中卵母细胞的发育速度慢于卵泡的发育速度，这是由于卵泡腔的快速增大引起卵泡发育较快，而卵母细胞到后期基本不再变化，这与李克美阐述的卵泡发育规律相一致。透明带厚度在次级卵泡到三级卵泡的阶段快于三级卵泡到成熟卵泡阶段。

本试验埋植组腔前卵泡中原始卵泡和初级卵泡数量显著增多，腔前卵泡的直径、卵母细胞直径和透明带厚度变化不显著。与毛梦菌等对猪腔前卵泡培养基中添加不同浓度的MLT 引起各组间卵泡生长但直径差异不显著的结果相一致。又据Adriaens 等报道添加MLT 的鼠腔前卵泡培养基中雄激素和孕激素的生成量增多。同时Shanghnessy 等研究发现切除垂体的兔和羊卵泡数量显著少于正常组。说明MLT 对卵泡发育的作用与卵母细胞和颗粒细胞的增殖分化无关，可能与MLT 调节性激素分泌间接作用于卵泡数量有关，但本实验次级卵泡数量差异不显著的机理尚不明确，其机理有待进一步研究，同时为探究MLT 对水貂体外培养条件下卵母细胞的发育奠定基础。

本研究中，埋植MLT 组有腔卵泡提前发育，这与赵英等对休情期银黑狐埋植7 个月MLT 可促进有腔卵泡发育的研究结果相一致。一方面可能与MLT 作用于HPG 轴间接调节性激素的分泌作用有关，卵泡的发育与促卵泡生成素（FSH）和促黄体生成素（LH）密切相关，MLT 进入到卵泡后会诱导一系列mRNA 的表达，在人的颗粒细胞中，MLT 可增加促黄体生成素受体（LH-R）mRNA、促性腺激素释放激素（GnRH）mRNA、促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）mRNA的表达，从而促进卵泡发育；另一方面可能与MLT的抗凋亡作用有关，过多的活性氧（ROS）可导致卵泡闭锁，而MLT 及其代谢产物是强大的自由基清除剂，能够降低氧化酶基因的表达，清除ROS，维持线粒体稳态，从而保护卵泡的继续成长，成为优势卵泡。因此，细胞外信号和卵泡内因子的共同协同调节促进有腔卵泡的提前发育，同时证实了本实验中卵巢形态学的发育与内部卵泡发育有关。为跟踪水貂繁殖性能的状况，探究MLT 埋植剂是否可提高水貂繁殖性能提供前期基础。

4 结 论

本实验结果显示，MLT 埋植剂（18 mg/ 只）埋植172 d 对配种准备期水貂卵巢发育、可视卵泡、原始卵泡和初级卵泡数量增多及有腔卵泡的提前发育均有促进作用，但对卵巢宽度、次级卵泡数量及腔前卵泡的直径、卵母细胞直径和透明带厚度没有影响。