奶牛不同体液中表征氧化应激生物标志物的研究进展

骆 琳，蔡 杰，邓蒙蒙，刘建新，王迪铭*

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州 310058）

氧化应激是乳腺炎、酸中毒、酮症和关节病等代谢性疾病的重要致病因素。因此，准确评估奶牛氧化应激状态在生产中尤为重要。由氧化应激引起的奶牛代谢稳态变化可通过血液、尿液、唾液和牛奶等体液中相关指标来表征。从动物生理和动物福利方面考虑，分析奶牛血液循环中的相关指标以及牛奶成分以评估奶牛健康状况，是判断奶牛潜在代谢疾病的简易有效方法。因此，寻找体内具有代表性的抗氧化剂和氧化剂作为生物标志物来反映机体氧化应激状态尤为重要。筛选氧化应激的合适生物标志物应是生化代谢过程中稳定的产物且在样品处理、加工、分析和储存过程中不容易损失，具有标准化的定量方法并可有效反映机体氧化程度，易于获取。本文主要阐述了全血、血浆/血清、牛奶样品中可反映奶牛氧化应激状态的主要标志物，以期为后续研究氧化应激相关疾病提供一定参考。

1 氧化应激的成因及其与奶牛健康的关系

在正常情况下，生物体内的自由基总是处于不断产生和不断消除的动态平衡中。氧化应激是机体自由基（活性氧、活性氮）生成/消除的稳态失衡所导致的机体代谢紊乱的一种现象，其本质是自由基产生过度和内源性/外源性抗氧化系统对自由基消除能力减弱的障碍。机体细胞的氧化还原稳态由其复杂的内源性/外源性抗氧化防御系统来保证（图1），该系统包括内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶），以及外源性非酶化合物[如谷胱甘肽、蛋白质（铁蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、白蛋白）]和低分子量清除剂（如尿酸、辅酶Q）。当机体细胞抗氧化能力不足以抵消自由基的生成时，机体极易处于氧化应激状态。因此，氧化应激是自由基发生增加和保护性抗氧化防御系统活性降低的综合结果。

图1 生物机体活性氧代谢物的防护系统[5]

在实际生产过程中，氧化应激与奶牛疾病发生之间存在着紧密联系。Laliotis 等在研究围产期奶牛氧化应激生物标志物与临床乳腺炎发病率的关系时发现，患有乳腺炎组的奶牛体内自由基含量极显著高于对照健康组奶牛，同时体内抗氧化能力极显著低于对照组。Tsuchiya 等在研究围产期健康荷斯坦奶牛和产后患有酮病、皱胃移位奶牛氧化应激标志物的变化时发现，患有疾病的奶牛体内氧化应激水平较健康对照组显著升高。此外，有研究表明，产犊前高体况评分的奶牛在产后体重会损失较多，血液循环中的抗氧化能力较低，自由基含量较高。综上，当奶牛机体自由基发生增加和保护性抗氧化防御系统活性降低时，会发生氧化应激，从而更易患有乳房炎、酮病等多种代谢性疾病。

由氧化应激引起的奶牛疾病会降低奶牛产奶量，增加代谢疾病发生率，并会导致损失难以量化的间接成本（如发情延迟、配种延迟以及重复配种）。因此，通过检测奶牛体内的抗氧化能力和自由基含量，来评判奶牛机体氧化应激水平，对围产期、高产等特定群体奶牛的健康评估具有重要意义。

2 奶牛不同体液中的氧化应激生物标志物

2.1 奶牛血清/血浆中的氧化应激生物标志物

2.1.1 活性氧代谢物 生物系统中最丰富的自由基是以氧为中心的自由基及其代谢产物，通常称为活性氧。活性氧作为细胞代谢的正常副产物连续形成。低浓度活性氧对于蛋白质磷酸化、转录因子激活、细胞分化、凋亡、卵母细胞成熟、类固醇生成、细胞免疫和微生物防御等生理过程必不可少。然而，当活性氧过量产生时，它们会损害细胞脂质、蛋白质和脱氧核糖核酸，从而损害细胞功能。活性氧代谢物是一个集合术语，不仅包括氧中心自由基（如超氧阴离子和羟基自由基），还包括一些氧的非自由基衍生物（如过氧化氢和次氯酸）。活性氧代谢物试剂盒可评估血浆和其他生物液体中的氧化水平，其测试已经使用电子自旋共振进行了验证。电子自旋共振被认为是测量总氧化状态的“金标准”，但其方法复杂且大多数实验室缺少特定的技术支持，不适合常规分析。血浆中活性氧代谢物含量已被认为是自由基产生的指示物，且活性氧代谢物试剂盒检测已用于监测奶牛的氧化应激状态。Fiore 等研究发现，产后皱胃左方变位奶牛体内用来表征氧化能力的活性氧代谢物含量较对照组显著升高，表明患病奶牛经历了氧化剂与抗氧化剂之间的不平衡。因此，可通过检测体内活性氧代谢物含量来预测奶牛机体的氧化应激状态。

2.1.2 丙二醛和硫代巴比妥酸活性物质 不饱和脂肪酸是对自由基损伤最敏感的底物之一，很容易受到羟基的过氧化作用。丙二醛是多不饱和脂肪酸自由基诱导分解过程中形成的几种低分子量终产物之一，被认为是脂质氧化衰变的公认标志，也是表征机体氧化应激的最佳指标。Milne 等研究已经发现，体内丙二醛含量与其他标记物（如F2-异前列腺素）有极显著相关性；Tsuchiya 等也发现，围产期奶牛的丙二醛与游离脂肪酸（FFA）和-羟丁酸等体脂动员相关指标也存在显著相关性。因此，丙二醛可作为一种预测机体氧化损伤的较好指标。值得注意的是，由于测量的丙二醛特异性低，只能在体内检测到一小部分，但丙二醛很容易与硫代巴比妥酸活性物质反应生成红色素，这种红色素可以通过分光光度法以硫代巴比妥酸活性物质形式轻松测得。因此，也可通过检测硫代巴比妥酸活性物质含量表征机体氧化应激状态，这种检测方法经济、简便、快捷，已经被广泛用于评估奶牛机体的氧化应激状态。

2.1.3 F2-异前列腺素 氧化应激的严重程度可以通过测量任何大分子损伤来确定，但脂质过氧化程度通常被用来评估奶牛的氧化状态。过氧化脂质通常是由酶促反应产生，但也可以通过活性氧直接氧化脂质而非酶促形成。脂质是对氧化损伤最敏感的大分子，由非酶生成产生可量化的氧化脂质（如异前列腺素）是人类医学中量化氧化应激的生物标志物，它们可用作氧化应激的特异性和敏感性标记。最近，异前列腺素（一种基于酶联免疫吸附试验的测定指标）被认为是最可靠的脂质氧化标记物，该标志物的应用可更好地揭示反刍动物围产期脂质过氧化状态。此外，Kuhn 等发现，泌乳奶牛血浆15-F2t-异前列腺素浓度的增加与较高的血浆氧化应激指数相一致，进一步表明血浆15-F2t-异前列腺素是评估奶牛不同泌乳阶段氧化应激的一种更全面有效的氧化平衡测量指标。

2.1.4 谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶是细胞内抗氧化防御的主要形式。超氧阴离子自由基是生物体内正常的代谢产物，但是自由基的积累会使细胞膜的脂质发生过氧化作用而引起膜裂变，导致细胞损伤甚至死亡。超氧化物歧化酶的主要功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，是生物体内最重要且最佳的自由基清除剂，维持着机体的代谢平衡；谷胱甘肽过氧化物酶通过催化氢和脂质过氧化物的还原，可直接清除自由基歧化过程中产生的过氧化氢，从而有助于动物组织的氧化防御。Yu 等发现，在热应激条件下，奶牛体内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量显著降低，且超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量与奶产量呈显著正相关。因此，在热应激条件下可通过检测超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量来评估奶牛体内的抗氧化状态，并可及时预防氧化应激对奶牛造成的危害。

2.1.5 总抗氧化能力 由于很难单独测量每种抗氧化成分及其在血浆中的相互作用，可通过检测当量抗氧化能力来评估机体总抗氧化能力，这种检测结果可表征样品中存在的所有抗氧化剂（如白蛋白、硫醇、胆红素和超氧化物歧化酶）在机体内的综合作用。总抗氧化能力的测定考虑了血浆和体液中所有抗氧化剂的累积作用，提供了一个综合参数，而不是简单地测量抗氧化剂的活力总和。Habiballah 等发现，测量反刍动物的总抗氧化能力可能比单一参数更具有代表性。Omidi 等发现，经产奶牛体内血浆总抗氧化能力较初产奶牛显著升高，并高于泌乳早期/盛期奶牛、干奶期奶牛体内总抗氧化能力，首次表明临床上明显健康的奶牛可能具有较低的总抗氧化能力（尤其是初产奶牛），这种情况可能使奶牛对压力、疾病或健康问题更敏感。

2.1.6 生物抗氧化潜能 生物抗氧化潜能主要是衡量外源性抗氧化剂（如尿酸、抗坏血酸、蛋白质、-生育酚和胆红素等）水平。在奶牛泌乳早期和泌乳中期的测定发现，生物抗氧化潜能可作为评估奶牛机体抗氧化能力的有效指标。有研究表明，在日粮中添加精料可以减少牧草的摄入量并增加一些抗氧化剂在瘤胃中的降解；当奶牛饲喂玉米青贮饲料和精料补充料时，生物抗氧化潜能显著降低，表明补充的精料显著降低了体内的抗氧化剂水平。牧草的可变性以及在反刍动物饲粮中最大化利用牧草的方式会改变其营养成分，从而可能会影响奶牛机体的氧化应激状态。事实上，抗氧化剂系统成分的变化通常不是原因，而是由更高的自由基活性诱导的氧化应激的结果。以上研究提示，血浆生物抗氧化潜能含量的降低也可能是活性氧代谢物含量升高的原因。

2.1.7 氧化应激指数 在生理条件下，机体通常有足够的抗氧化储备来应对自由基的产生，但当自由基的生成超过机体的抗氧化能力时，即体内氧化剂和抗氧化剂含量失衡时，就会产生氧化应激。第一个使用氧化剂/抗氧化剂比例作为评估机体氧化状态的有效指标是在《人类医学》杂志上发表的，该比例增加表明由于活性氧产生或防御性抗氧化剂消耗的增加而导致氧化应激的风险增加。同时Pietro在综述中提出，氧化剂/抗氧化剂比例也可作为指示奶牛患病风险的指标。

Abuelo 等研究发现，当对奶牛整个过渡时期血清中活性氧自由基和血清抗氧化能力的结果进行单独评估时，没有发现氧化和抗氧化这两种指标之间有显著差异；当用两者的比例对氧化剂和抗氧化剂进行综合评估时，发现奶牛产前和产后阶段存在统计学差异，提示奶牛在分娩前后经历了氧化应激。Laliotis 等研究发现，患有乳腺炎的奶牛其氧化应激指数值极显著高于对照健康组奶牛，表明患有乳腺炎的奶牛体内氧化应激水平较高。在人类医学中的研究也发现，当将体内氧化剂和抗氧化剂含量以比例结合时，氧化应激水平和病理之间的相关性更高。

2.2 奶牛全血中表征的氧化应激生物标志物 红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，也是维持生命活动最重要的细胞之一。因红细胞具有运输氧气的特殊生理功能，红细胞必须始终暴露在每个血管环路以及其他各种不同的外源性物质中。氧化应激在很多生理和病理现象中扮演重要的角色，在一些病理（如免疫紊乱、感染、理化因素等）条件下，红细胞会处在不断变化的氧化应激环境中。红细胞自身就有一个抗氧化系统来抵抗红细胞的氧化反应。但当机体处于氧化应激状态时，红细胞的抗氧化系统不能有效地清除血红蛋白自我氧化生成的过氧阴离子自由基，导致红细胞中氧自由基大量蓄积，进一步氧化细胞中的主要蛋白质和脂质，使红细胞的功能结构遭到破环，导致红细胞损伤。故氧化应激是红细胞损伤最常见的原因，因为红细胞对氧化应激具有高度的易损性，已经被作为模型来研究生物膜的氧化损伤。

Gaál 等测定犊牛出生时全血自由基稳态浓度、红细胞脂质过氧化物（丙二醛）和抗氧化酶活性（谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶）、血浆总抗氧化能力以及产犊母牛的血浆抗氧化能力发现，犊牛出生时体内已存在氧化应激；同时产犊当天奶牛体内总抗氧化能力显著低于非产犊奶牛，表明产犊作为一种应激原会导致奶牛机体短期氧化还原失衡。Lakritz 等研究发现，热应激显著降低了奶牛全血中红细胞谷胱甘肽浓度并增加了氧化型谷胱甘肽浓度，表明热应激能够在健康的泌乳奶牛中诱导氧化应激。综上，可通过检测全血红细胞中丙二醛、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽含量以及抗氧化酶的活性来评估奶牛的氧化应激状态。

2.3 奶牛乳中表征的氧化应激生物标志物 牛奶的质量与乳腺的健康密切相关。牛奶中能检测到的抗氧化活性物质主要可分为蛋白质和非蛋白质两大类。蛋白质类抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶以及乳成分中的酪蛋白和多肽等；非蛋白质类抗氧化剂包括维生素C 和维生素E 和类胡萝卜素。事实上，不同的牛奶成分已被证明具有特定的抗氧化能力。Cristina 等研究发现，牛奶中含有大量活性物质，在抑制脂质过氧化和加快超氧化物自由基清除速率方面具有重要价值（如酪蛋白和乳清在抑制细胞过氧化物形成中发挥着重要作用）。Talukder 等通过检测全脂牛奶样品（生物抗氧化潜能）、脱脂奶样品（脂质过氧化物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和铜蓝蛋白）、乳清样品（高级氧化蛋白产物）相关指标含量变化评估处于发情周期的奶牛有无排卵，发现排卵奶牛的超氧化物歧化酶水平升高，而脂质过氧化物、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽水平降低，提示乳中抗氧化相关指标在奶牛发情鉴定中可作为重要表征指标。

另外，Kuhn 等研究首次表明乳中15-F2t-异前列腺素含量可有效指示乳腺脂质过氧化程度，作为乳腺炎和哺乳早期奶牛氧化应激的评估标准。牛奶活性物质的组成是乳腺代谢特征的直接表征，作为一种非侵入性样品，获取并分析牛奶中一些关键活性物质，在监测奶牛个体健康状态和应激程度等方面具有巨大应用潜力。

3 小结与展望

奶牛不同体液中潜在的生物标志物可反映机体氧化应激状况。因此，可通过评估全血中红细胞、血清/血浆以及牛奶中氧化和抗氧化水平来表征奶牛机体的氧化平衡状态。根据不同试验需求，检测不同体液中的氧化应激生物标志物，并对已采用的不同方法进行结果比较，可以更好地综合评估奶牛的健康和代谢状况，确定适合反刍动物氧化应激的检测方法，从而为不同生物标志物建立正常生理范围，确定奶牛氧化应激阈值，以期推动反刍动物氧化应激研究和应用领域更快、更好地发展。