加速溶剂萃取-在线净化-液相色谱串联质谱法检测污泥堆肥样品中三氯生和三氯卡班

刘媛媛，张倩，梁涛，郑国砥，王凌青

(中国科学院，地理科学与资源研究所，北京 100101)

三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是高效广谱抗菌剂，因其皮肤相容性好和脂溶性较强，被广泛应用于护肤品、纺织品和消毒剂等产品[1-2]。但TCS和TCC均具有较强的生物毒性，是一种新型内分泌干扰物，可通过食物链在生物体富集，危害人体健康和生态系统。对TCS和TCC的毒性研究表明，小鼠急性经口的半数致死量(LD50值)为1 470 mg/kg，属于低毒[3]，但长期暴露于大剂量TCS中，会引发免疫系统紊乱及肝肾受损[4]，TCC可通过影响细胞周期进程等破坏小鼠卵母细胞的成熟，产生生殖毒性[5]。目前环境中TCS和TCC的重要来源是污水处理厂的污水和底泥，传统活性污泥法能去除污水中90%的TCS和TCC，但仅有30%～40%可被生物降解[6]。因TCS和TCC的疏水性和污泥的强吸附性，其大部分被吸附储存在污泥中，有研究表明，污泥中TCS的质量分数为0.028～37.189 mg/kg[7-8]，TCC为2.17～5.97 mg/kg[9]。因此，建立一种准确、快速、低成本的检测方法具有重要意义。

污泥堆肥样品中的TCS和TCC的检测难点在于样品基质复杂，且对疏水性有机物有强吸附作用。基于此，通常污泥堆肥样品的前处理步骤分为萃取和净化。目前，应用到污泥堆肥样品的萃取方法有索氏提取法[10-12]、加速溶剂萃取法(ASE)[13-15]和超声提取法等[16-17]，净化技术一般有柱层析法、凝胶渗透色谱法[11,18]和固相萃取法等[19]。与索氏提取法等传统萃取技术相比，加速溶剂萃取法耗时少、溶剂消耗少、提取效率高，已被广泛应用，但后续净化步骤仍然耗时费力。通过在萃取池内填入吸附材料实现一步提取净化的方法更高效、快速且误差更小[20]，这种方法已被用来检测不同基质样品中的持久性有毒污染物，如复杂基质中的农药[21]，土壤[22]、沉积物[23]和污泥样品[24]中的多环芳烃，土壤[25]、大气颗粒物[26]、饲料[27]及海洋样品[28]中的多溴二苯醚(PBDEs)等，但对污泥堆肥样品中的TCS和TCC的检测方法还不完善。

建立了加速溶剂萃取-在线净化-液相色谱串联质谱法检测污泥堆肥样品中的TCS和TCC的分析方法，对萃取溶剂、温度、静态时间、循环次数以及净化吸附材料的类型和用量进行优化，为污泥堆肥样品中TCS和TCC的风险评估和污染管理提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器： LCMS 8045高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(日本岛津公司)；Shim-pack GIST-HP C18色谱柱(3.0 μm×2.1 mm×50 mm，日本岛津公司)；ASE 350加速溶剂萃取仪(美国Thermo Fisher公司)；R-215旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation公司)；玻璃纤维膜(30 mm，美国Thermo Fisher公司)；有机滤膜(0.22 μm，上海安谱公司)。

试剂：TCS和TCC标准样品(1 g /L，美国AccuStandard公司)；正己烷、二氯甲烷、甲醇、丙酮(HPLC级，德国Duksan Pure Chemicals公司)；100～300目中性氧化铝、100～200目弗罗里硅土、40～43目酸性硅胶、N-丙基乙二胺(PSA)(德国CNW试剂公司)；铜粉、无水硫酸钠(优级纯，上海安谱公司)；10～20目硅藻土(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 样品采集与储存

采集：样品取自上海松江污水处理厂，含水率为80%～90%。

储存：于-20 ℃下转移至实验室，使用冷冻干燥机低温冷冻干燥，研磨过60目筛后于4 ℃黑暗条件储存。

1.3 样品前处理

加速溶剂萃取-在线净化法是通过在萃取池中填入特定的填料和样品，同时完成样品的萃取和净化的方法。在34 mL的萃取池中，填料的装填顺序依次为：2层玻璃纤维膜、无水硫酸钠(干燥剂)、一定量的净化吸附材料(依据样品而定)及样品、0.4 g硅藻土和0.1 g铜粉(用于除硫)的混合物，每层用玻璃纤维膜隔开。对溶剂种类、静态萃取时间、循环次数及温度等萃取参数进行考察。萃取液氮吹干后，由0.5 mL甲醇复溶，过0.22 μm有机滤膜后待测。

1.4 高效液相色谱-三重四极杆质谱仪法检测

使用高效液相色谱-三重四极杆质谱仪对样品进行检测。流动相为V(甲醇)∶V(水)=75∶25；流量为0.3 mL /min；进样量为5 μL；柱温为 40 ℃；外标法定量。

采用电喷雾电离(ESI)负离子模式；雾化气为氮气(流量3.0 L/min)；加热气为空气(流量10.0 L/min)；干燥气为氮气(流量10.0 L/min)；碰撞气为氩气。接口温度为300 ℃；脱溶剂管温度为250 ℃；加热模块温度为400 ℃。

2 结果与讨论

2.1 检测方法的建立

高效液相色谱-三重四极杆质谱仪的ESI离子源优化参数见表1。使用TCS和TCC混合标准样品及实际堆肥样品对检测方法进行验证，在通道288.8>35.1和314.85>160的质谱图见图1(a)—(d)。由图1可见，该通道下TCS和TCC的丰度值较高，实际样品分离度好，无干扰，3 min内即可完成检测。该方法具有快速高效、灵敏度高的优点。

表1 ESI离子源优化参数

图1 TCS和TCC混合标准样品及实际样品在多反应监测(MRM)模式下的色谱图

2.2 加速溶剂萃取-在线净化条件的确定

影响加速溶剂萃取-在线净化效率的因素有很多，其中非关键性参数影响较小[26]。非关键参数设定为：静态萃取时间5 min，冲洗体积60%，压力10 342 kPa。工作参数的优化主要集中在净化吸附材料的选择、循环次数、萃取溶剂及温度条件。对工作参数的评估采用样品加标法，TCS和TCC的加标质量分数分别为100和20 ng/g(干重)。

2.2.1 净化吸附材料的选择

净化吸附材料的优化主要是对其类型及用量进行优化，目的是尽量多地去除干扰物，提高目标物的回收率。实验中使用了PSA、弗罗里硅土、中性氧化铝、酸性硅胶、酸性硅胶/弗罗里硅土这5种不同的吸附材料，其对应的萃取液的颜色和状态也完全不同。以PSA为吸附材料的萃取液是黄色、有悬浮物的浑浊液体，酸性硅胶、中性氧化铝、弗罗里硅土的萃取液颜色逐渐变浅变透明，酸性硅胶/弗罗里硅土的萃取液最干净。5种吸附材料的回收率均>80%(图2)。因此，选择能够更好地去除干扰物，且对目标物吸附较少的酸性硅胶/弗罗里硅土为吸附材料。

图2 5种不同吸附材料的回收率(n=3)

对酸性硅胶/弗罗里硅土的用量进行优化，实验中分别采用了酸性硅胶、弗罗里硅土、样品三者质量比为4 g/5 g/0.5 g，3 g/4 g/0.5 g和2 g/3 g/0.5 g。3 g/4 g/0.5 g比2 g/3 g/0.5 g的色谱图基线低，萃取液颜色更浅，但与4 g/5 g/0.5 g几乎没有差别。因此三者质量比为3 g/4 g/0.5 g可去除杂质，得到干净的待测样品。

2.2.2 萃取溶剂和温度的选择

采用了双因素实验，考察萃取溶剂和温度对TCS和TCC回收率的影响。选择不同极性的溶剂作为萃取溶剂，如正己烷、二氯甲烷、甲醇、丙酮、正己烷/丙酮(V∶V=1∶1)和正己烷/二氯甲烷(V∶V=1∶1)。选择丙酮和甲醇是因其作为萃取溶剂时回收率高[29-30]，但实验发现其萃取液颜色较深，基质干扰较多。因此，选择正己烷、二氯甲烷和正己烷/二氯甲烷作为萃取溶剂考察对象，温度选择40，70，100 和130 ℃。通常温度越高，溶剂黏性越小，目标物转移到溶剂中的速度越快。但对于某些化合物，有时结果却相反。

萃取溶剂和温度对萃取TCS和TCC的影响见图3(a)(b)。由图3可见，以正己烷为溶剂时，回收率较低；以二氯甲烷和正己烷/二氯甲烷为溶剂时，回收率相差不大。由于正己烷/二氯甲烷相对更环保，因此选择其为萃取溶剂。以正己烷/二氯甲烷为萃取溶剂时，温度从40 ℃升高至 100 ℃，回收率随之升高，继续升至130 ℃时，反而略有下降，因此选择萃取温度为100 ℃。

图3 萃取溶剂和温度对回收率的影响

2.2.3 循环次数的选择

根据已选定的萃取条件，对萃取循环次数进行优化。对加标样品(10，80 ng/g 的TCC和50，400 ng/g的 TCS)分别进行1，2，3次循环。不同循环次数对高、低质量分数的加标样品回收率的影响见图4(a)(b)。由图4可见，对质量分数较低的加标样品，循环次数对回收率影响不大，都能得到较高的回收率。对质量分数较高的加标样品，循环2次比1次回收率明显提高，但增加到3次时，回收率无明显变化，因此选择循环次数为2。

图4 不同循环次数对高、低质量分数的加标样品回收率的影响

2.3 方法验证

通过测试加标污泥样品(1，10，80 ng/g 的TCC和5，50，400 ng/g的 TCS)对该方法进行评估。加标样品的回收率和精密度见表2。由表2可见，所有样品的回收率均>90%，且中、高质量分数的加标样品的回收率要高于低质量分数的加标样品。将质量浓度为0.5，5，25，50，100，250和500 ng/mL的TCS和0.1，1，5，10，20，50和100 ng /mL的TCC混合标准溶液按照上述方法进行检测，以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，采用外标法制作标准曲线。根据《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)，将标准溶液加到与样品相似的基体中，采用相同的样品处理方法和分析方法，对质量浓度为估计方法检出限值3～5 倍的样品进行10次平行测定，计算检出限和定量限。方法检出限为2.821倍的标准偏差(RSD)(2.821为自由度为9，置信度为99%时的t分布值)，以4倍检出限作为定量限。其线性范围、相关系数、检出限和定量限见表3。由表3可见，TCS和TCC在该质量浓度范围内线性良好。

表2 加标样品的回收率和精密度(n=6)

表3 加标样品的线性范围、相关系数、检出限和定量限(n=10)

2.4 实际样品测定

采用上述方法对上海某污水厂的含水率为80%的污泥堆肥样品进行定量分析，TCS、TCC、总氮和总碳测定结果见表4。由表4可见，冷冻干燥后，总碳占比为3.15 %～3.83%，总氮占比为 27.3%～30.5%，TCS和TCC的质量分数分别为1.31～1.51和0.61～0.81 μg/g(干重)。TCS和TCC的质量分数与总碳、总氮之间存在相关关系，随着总碳、总氮占比的增加，其质量分数也随之增大，这与前人的研究一致[31]。

表4 实际样品中TCS、TCC、总氮和总碳测定结果

3 结语

采用加速溶剂萃取-在线净化-液相色谱串联质谱法测定污泥堆肥样品中的TCS和TCC，该方法效率高、操作简便，使前处理时间和萃取溶剂用量大大减少。采用优化后的方法，对污泥堆肥样品进行加标回收实验，低、中、高质量分数样品的回收率为90.3 %～99.8%，RSD均<10%，能够满足实际污泥堆肥样品中TCS和TCC检测的要求。