斑马鱼肝脏组织油红O 染色方法比较优化

赵方新，李 怡，张 烜，陆景坤，牛 燕，丁 枫，武建强

（内蒙古医科大学基础医学院医学实验中心，内蒙古 呼和浩特 010110）

斑马鱼作为动物疾病模型相较于传统的啮齿动物模型具有独特优势，已广泛应用于医药卫生、毒理检验以及环境科学等众多领域[1]。斑马鱼肝脏的细胞表型与哺乳动物高度相似，拥有相同的功能，包括胆汁分泌、糖原和脂质储存、胰岛素反应、异种物质和氨代谢等[2]，因此众多学者利用斑马鱼作为动物模型在肝病、肝功能等方面进行研究。油红O（Oil Red O，ORO）属于偶氮染料，具有很强的脂溶性和染脂性，在脂类中的溶解度比在溶剂中大，可与甘油三酯结合呈小脂滴状，滴于冰冻组织切片时油红O 溶于组织内的脂质（脂滴）中，使其呈橘红色，因此油红O 染色技术可以用来鉴定肝脏组织脂肪沉积情况，具有细胞定位功能作用，有助于判断及定性疾病[3，4]。斑马鱼脂肪肝病模型日渐成熟，冰冻切片油红O 染色技术更是研究脂肪性肝病的必要选择，但因斑马鱼肝脏结构与常用啮齿类动物差别大，体量微小，质地薄软，使用油红O 染色时斑马鱼肝组织的前处理以及切片厚度、染色时间以及步骤尚无统一标准。为了今后科研工作中斑马鱼肝脏疾病模型鉴定和研究提供技术参考，本研究利用斑马鱼肝组织冰冻切片，以探索不同前处理步骤、切片厚度、染色时间等条件下，最佳的斑马鱼肝脏组织油红O 染色方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料 野生AB 型斑马鱼，3 月龄，上海费曦生物科技有限公司；4%多聚甲醛，Biosharp；异丙醇等，天津市鑫铂特化工有限公司；油红O，苏木素染液，甘油明胶封片剂，北京索莱宝科技有限公司；OCT 包埋剂，日本樱花；粘附载玻片，盖玻片，江苏世泰实验器材有限公司；冷冻切片机，台式显微镜等由内蒙古医科大学医学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 染色液以及脱水溶液的配置 ①油红O 染色液：称取油红O 粉末500 mg 溶于100 ml 异丙醇适度震荡制成油红O 饱和储备液。实验前取适量储备液与ddH2O 制成60%染色液。染色前用0.42 μm 针式有机滤器进行过滤后得到实验染色液[5]（2 h 内使用）；②蔗糖脱水液：称取10 g（20 g，30 g）蔗糖溶解于100 ml 纯水中，4 ℃备用。

1.2.2 取材 3 月龄野生AB 型斑马鱼，禁食3 d 冰水浴处死，沿斑马鱼泄殖孔向前剪开小口，浸入4%多聚甲醛，4 ℃过夜，第2 天将斑马鱼固定于台式显微镜下，取出肝脏部分浸泡在4%多聚甲醛4 ℃过夜。次日取出，浸入10%蔗糖溶液，组织沉底后转入20%蔗糖溶液，直至在30%蔗糖溶液完成脱水。略吸去水分，OCT 包埋，放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 切片 适当修块，肝脏组织露出后，设置不同厚度连续切片，粘附载玻片粘取切片。

1.2.4 染色 晾片：染色前冷冻切片在室温晾干（1 h 或无水气即可）。前处理：切片浸泡在4%多聚甲醛中固定10 min（或不固定）。油红O 染色：将切片平放在湿盒中并滴加足量的油红O 染色液（经0.22 μm 针式滤膜过滤器滤过），合盖停留不同时间（5、10、15 min）。分化：75%酒精、60%异丙醇分化2 s 后ddH2O 漂洗5 s，或直接ddH2O 浸洗30 s。苏木素染色：切片置于苏木素中停留不同时间（1、3、5 min）。漂洗：ddH2O 浸泡30 s 去浮色。1%盐酸酒精分化2 s，流水冲洗2 min返蓝。甘油明胶封片。将切好的冷冻切片分为四组，每组内切片来源于同一组织块。厚度组包含6、8、10、12 μm 四种不同厚度各2 片；其他各组切片厚度均为8 μm，每种不同的处理方法处理2 张切片。

1.3 观察指标 观察成片后显微镜视野内（×200 和×400）组织情况，判断有无明显裂痕缺损脱片，橘红色脂滴染色是否清晰、细胞边界是否明显，整体背景染色情况以及是否可以分辨出深染的细胞核。

2 结果

2.1 切片厚度选择 切片机分别设置6、8、10、12 μm，做同样连续切片，后执行相同的处理步骤。切片厚为5 μm 时，组织脱片以及破裂程度较大，不完整；厚度为8 μm 和10 μm 时，视野中基本没有脱片和破损，无残留背景，细胞中间有深染的细胞核，细胞内脂滴呈橘红色，定位清楚，二者没有明显差异；当厚度为12 μm 时，细胞结构模糊，脂滴不清晰，见图1。因此，斑马鱼肝脏冷东切片的适宜厚度应设置在8～10 μm。

图1 不同厚度的斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色效果比较（×200）

2.2 染色前处理设置 取8 μm 的切片分组行不同染色前处理。室温晾干1 h，经4%甲醛固定10 min 后染色的切片，200 倍视野下组织基本完整，无脱落、破裂的情况，染色定位清晰，效果满意。室温晾干1 h后无甲醛固定步骤染色的切片，组织轻度脱落、破裂，有均匀分布的空洞，可能影响最终对于脂滴的的判断。而仅室温晾到无水气的切片，无论有无甲醛固定步骤，都有较为明显的脱片现象，见图2。

图2 斑马鱼肝脏冷东切片不同染色前处理效果比较（×200）

2.3 油红O 染色时间与分化方法的选择 取8 μm的切片执行不同的染色时间（8、10、15 min），每组内用不同的分化液（75%乙醇、60%异丙醇、ddH2O）处理。当油红O 染色5 min 时，油红O 着色均较浅（图3A、3B、3C）。染色10 min 时，经过75%乙醇、60%异丙醇分化后，镜下可见组织切片中的脂质被油红O染成橘红色（红色），细胞核为蓝紫色，无背景残留（图3D、3E），ddH2O 分化30 s 的背景残留多（图3F），可见ddH2O 无法洗脱残留油红O。相比而言，同一组织的切片，60%异丙醇分化后的脂滴更多，75%酒精分化的脂滴相对更少，75%酒精对脂质的洗脱力更强。染色时间延长至15 min 时，三种分化方法均背景着色严重（图3G、3H、3I）。因此，油红O染色10 min 后使用60%异丙醇分化效果最好。

图3 不同染色时间与不同分化方法的效果比较（×200）

2.4 苏木素染色时间比较 取8 μm 切片，苏木素染色时间设置为1、3、5 min，其他步骤相同。苏木素染色1 min 时（图4A、4D），细胞核染色过浅，边缘模糊不清；苏木素染色3 min 时（图4B、4E），细胞核呈深浅适宜的蓝紫色，轮廓清晰；苏木素染色5 min 时（图4C、4F），细胞核着色加深，油红O 着色有所减少，因此苏木素在斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色中设置为3 min 较为适宜，见图4。

图4 斑马鱼肝脏冷冻切片的油红O 染色中苏木素染色时间的效果比较

3 讨论

近年来，各类型斑马鱼疾病模型以及转基因斑马鱼品系日渐完善，也因其成模快、价格便宜、养殖要求低等独特的优势被越来越多的研究团体和人员使用[6-9]。在研究肝脏疾病、相关药物筛选和评价等方面亦是如此，斑马鱼肝脏在细胞、功能、信号传导以及疾病的细胞过程等方面与人类十分相似[10-12]，在基因、蛋白水平上也与人类也具有高度保守性，这使斑马鱼成为研究人类肝脏疾病基本机制的良好工具。

油红O 染色法因其性价比高和操作相对简单，是病理诊断和科研的常用方法，在肝脏疾病，尤其是脂肪性肝病的研究中是必不可少的[13-15]。但与小鼠等动物的肝脏相比，斑马鱼肝脏[16-17]薄而狭长，分为三叶，包绕在肠道外，结缔组织极少，上述特点决定斑马鱼肝脏的质地较为软且脆，因此适合于哺乳动物肝脏冷冻切片油红O 染色法并不完全适用于斑马鱼肝脏。另外斑马鱼肝脏组织在新鲜状态下不易剥离，经过实验发现将延泄殖孔向前剪开5 mm 左右在4%多聚甲醛中浸泡数小时后再进行解剖更易操作，此时经过固定后的肝脏较硬且形状固定，可以剥出完整的肝脏组织。OCT 包埋时应根据需要调整位置保证切片时能切到较大面积的肝实质。一般而言，实验结束会收取较多样品组织，不可能在短时间内完成切片以及染色等全部步骤，需要冷冻储存。本实验发现，不经脱水固定的斑马鱼肝脏样品组织冷冻后再切片会有较大孔洞，且容易出现褶皱破损，这可能与冷冻中产生的冰晶有关[18]，因此包埋前应进行10%～30%蔗糖溶液梯度脱水，一般遵循组织块沉底后转入下一梯度，完成脱水后直接OCT 包埋可储存在-80 ℃冰箱中随时取用。因组织块较小，OCT包埋时应根据需要调整位置保证切片时能切到较大面积的肝实质。当一次性切取较多冷冻切片时，可以将切片保存在-20 ℃冰箱里，经过脱水固定处理的组织切片可以保存较长时间，不影响后续染色效果。根据实验结果，冰箱中的切片在染色前应提前在室温彻底晾干复温1 h，否则易出现脱片破裂等情况。据研究报道[19]，油红O 染色步骤说法不一且少有针对斑马鱼肝脏的处理方法。本次实验设置不同厚度、不同染色前处理、不同染色时间、不同分化液，对比显微镜下效果，得到适合于斑马鱼肝脏的处理步骤：切片厚度8～10 μm，室温晾干1 h，甲醛（4%）固定10 min，油红O 染色湿盒滴染10 min，60%异丙醇分化2 s，ddH2O 浸洗浸泡5 s 后，苏木素染色3 min，ddH2O 浸泡30 s 去浮色，1%盐酸酒精分化2 s，流水冲洗2 min 返蓝，甘油明胶封片。此方法步骤简单，耗时短，切片染色效果好，可快速简便的获得满意的斑马鱼肝脏冷冻油红O 染色片。

综上所述，本次优化的斑马鱼油红O 染色方法可以较为清晰地显示肝脏脂滴，可辨别细胞核轮廓位置，进而对斑马鱼肝病模型中的脂肪变性情况进行定位与半定量的分析。