鼻咽癌中IKKβ 和Ki-67 的表达与肿瘤侵袭转移的关系

周 梅，赵 刚 ，禤瑞霞，陈钰伟，汪 芸，封慕茵

（中山市中医院病理科1，超声科2，广东 中山 528400）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，每年新发鼻咽癌患者超过8.4 万人，鼻咽癌在东南亚和中国南部非常普遍[1]。鼻咽癌是一种低分化或未分化癌，对放疗较敏感，有远处转移倾向，因此，对于分期低非转移性鼻咽癌的治疗建议采用放疗，治愈率较高[2]。然而，由于早期鼻咽癌患者症状轻微，大多数患者就诊时已为晚期，主要采用多种联合放化疗模式治疗，但鼻咽癌Ⅲ期和Ⅳ期5 年总生存率仅为53%～80%和28%～61%[3]。迄今为止，鼻咽癌的基因组异常仍不明确，没有相应的靶向治疗。因此，寻找能够预测鼻咽癌预后或指导靶向治疗的分子靶点具有重要意义。NFКBp65 通路是一种调节免疫应答、细胞增殖、凋亡、胚胎发育、衰老和癌症的重要核转录调节通路[4]。NF-κB 通路活化受IκB 激酶（IKK）复合物调节，该复合物由2 个催化亚单位IKKα 和IKKβ 以及一个调节亚单位（NEMO）/IKKγ 组成[5]。IKKβ 是激活经典NF-κB 信号通路的关键环节，据文献报道NF-κB 信号通路在多种恶性肿瘤中激活，如头颈部肿瘤、胃肠道肿瘤、妇科肿瘤、胸部肿瘤和泌尿生殖系肿瘤等。细胞增殖指数（Ki-67）是评估肿瘤异质性和细胞生长的重要免疫组织化学标志物，参与细胞增殖、侵袭性和恶性潜能[6]。广东省是鼻咽癌的高发地区，IKKβ 是否与广东省鼻咽癌患者的发病相关尚不明确。基于此，本研究运用免疫组化及RT-PCR 的方法检测IKKβ 蛋白mRNA 在鼻咽癌患者组织中的表达，分析其与鼻咽癌各临床病理指标及Ki-67 增殖指数间的关系，探讨IKKβ在鼻咽癌发生发展中的作用，为靶向治疗和预后判断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018 年1 月-2019 年12 月中山市中医院门诊鼻咽疾病患者90 例，其中鼻咽癌60例，男41 例，女19 例；年龄16～80 岁，平均年龄（49.13±14.02）岁。鼻咽炎30 例，男20 例，女10 例；年龄18～70 岁，平均年龄（45.18±15.63）岁。手术活检标本经病理证实为鼻咽癌，所有病理切片由2 名病理医师同时阅片，根据分化程度，鼻咽癌可分为3种组织学类型：非角化性癌（分化型和未分化型）、角化性和基底样型鳞状细胞癌。鼻咽癌的组织学分型及分期标准参照2006 年世界卫生组织的标准。

1.2 主要试剂及方法

1.2.1 免疫组织化学 IKKβ 一抗购自Santa Cruz 公司，Ki-67 一抗及二抗购自福州迈新公司。所有样本均按照说明书的程序处理。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 厚连续切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预处理的载玻片上，用二甲苯和酒精脱蜡，柠檬酸盐缓冲液高压修复抗原4 min，加过氧化氢10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，切片用10% 的山羊血清阻断，IKKβ 和Ki-67（1∶100）一抗孵育2 h，二抗孵育30 min，DAB 显色，脱水，封片。

1.2.2 结果判定 结果由2 位病理科医师进行判定，采用双定量评分法进行评定：IKKβ 蛋白阳性表达为胞质内出现棕黄色颗粒，Ki-67 蛋白阳性表达为胞核内出现棕黄色颗粒。阳性染色强度评分：无染色颗粒为0 分，微弱染色颗粒为1 分，清晰染色颗粒且细胞质呈棕黄色为2 分，细胞质呈深棕色为3 分；阳性细胞数评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞数≤20%为1 分，阳性细胞数21%～50%为2 分，阳性细胞数＞50%为3 分；上述两项评分相乘，0～2 分为阴性，≥3 分为阳性表达。

1.2.3 提取总RNA、合成cDNA 所有标本经10%甲醛固定和石蜡包埋后，连续切片6 片，厚6 μm，使用总RNA 提取试剂盒（美国，QIAGEN）提取组织总RNA，用紫外分光法测取RNA 纯度，用反转录试剂盒（Promega 生物公司）进行反转录合成cDNA。将500 ng 总RNA 加入20 μl 反应体系中，反应条件：37 ℃15 min、85 ℃5 s、4 ℃延伸，获得cDNA 后放入-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 RT-PCR 检测IKKβmRNA 的相对表达量 采用RT-PCR 法对IKKβmRNA 的相对表达量进行检测。RT-PCR 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。引物由上海生工生物公司设计合成，以GAPD 为内参，具体如下：IKKβ-上游引物：5'-CCGACAGAGTTAGCACGACA -3'，IKKβ -下游引物 ：5' -GGCAATCTGCTCACCTGTTT-3'；内参GAPDH-上游引物：5'-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3'，GAPDH-下游引物：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3'。PCR 反应体系：SYBR 10 μl，cDNA2 μl，上、下游引物各0.4 μl，去离子水7.2 μl；在RT-PCR仪上进行反应，扩增条件为：95 ℃30 min 预变性；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环；绘制溶解曲线：95 ℃15 min、60 ℃15 s、95 ℃15 s。每个样本设3个复孔，重复检测3 次，取平均值。以GAPDH 为内参照，计算目的基因的相对表达量。计算公式:ΔΔCt=（CT 实验组目的基因-CT 实验组管家基因）-（CT 对照组目的基因-CT 对照组管家基因）。

1.3 统计学分析 用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间比较采用t检验；偏态分布的计量资料以[M（P25，P75）]表示，并采用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Pearson 相关分析法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎组织中的表达比较 免疫组织化学方法检测显示，IKKβ 蛋白在鼻咽癌组织中阳性表达细胞数较多，着色深，呈强阳性表达，而在鼻咽炎中呈弱阳性表达或阴性，见图1；IKKβ 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率为56.67%，在鼻咽炎组织中的阳性表达率为33.33%，IKKβ 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率高于鼻咽炎组织（P＜0.05）；Ki-67 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率为95.00%，在鼻咽炎组织中的阳性表达率为13.33%，Ki-67 蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率高于鼻咽炎组织（P＜0.05），见表1。

表1 IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎组织中的表达比较[n（%）]

图1 免疫组化染色

2.2 鼻咽癌组织中IKKβ 和Ki-67 蛋白表达的相关性 Pearson 线性相关分析显示，鼻咽癌组织中IKKβ 和Ki-67 蛋白的相对表达量呈正相关（r=0.262，P＜0.05）。

2.3 IKKβ mRNA 在鼻咽癌组织与鼻咽炎组织中表达比较 IKKβ mRNA 的表达溶解曲线和扩增循环图见图2；IKKβmRNA 在鼻咽癌中的相对表达量（1.1929±2.1870）与在鼻咽炎中的相对表达量（1.6007±0.4877）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 荧光定量扩增曲线图

图3 IKKβ mRNA 的相对表达量

2.4 IKKβ 蛋白的表达与鼻咽癌临床病理特征的关系 在鼻咽癌中，IKKβ 蛋白的阳性表达率与鼻咽癌肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期均有关（P＜0.05），肿瘤体积越大、有淋巴结转移、TNM 分期越高的鼻咽癌IKKβ 蛋白的阳性表达率越高；但IKKβ 蛋白的阳性表达率与性别、年龄、组织学分型无关（P＞0.05），见表2。

表2 鼻咽癌组织IKKβ 蛋白表达与临床病理特征的关系（n）

2.5 鼻咽癌组织中IKKβ mRNA 的相对表达量与临床病理特征的关系 RT-PCR 结果显示，IKKβ mRNA 在T1～2鼻咽癌中的相对表达量高于T3～4鼻咽癌（P＜0.05）；有淋巴结转移的鼻咽癌IKKβ mRNA 相对表达量高于无淋巴结转移的（P＜0.05）；鼻咽癌mRNA 在Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌组织中相对表达量高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）；IKKβmRNA 的相对表达量与鼻咽癌肿瘤大小、淋巴结转移状况、TNM 分期有关，而与患者年龄、性别、组织学分型无关（P＞0.05），见表3。

表3 鼻咽癌患者IKKβmRNA 表达与临床病理特征的关系[M（P25，P75）]

3 讨论

以往研究表明，遗传易感性、环境因素和EB 病毒（EBV）感染是鼻咽癌的三大致病因素。EBV 虽然普遍存在，但与鼻咽癌密切相关，在未分化型鼻咽癌中，几乎100%的肿瘤病灶存在EBV 基因组[7]。由于诊断延迟、远处转移和复发率高、缺乏靶向药物、临床预后欠佳，越来越多的研究者致力于揭示鼻咽癌发生和发展的分子机制，鼻咽癌信号通路的失调已经被广泛研究。NF-κB 信号通路在调节细胞存活、增殖、代谢、血管生成、炎症和细胞黏附/迁移的基因表达中起关键作用，多种炎症性疾病和癌症已显示NF-κB 信号传导失调导致该途径激活，NF-κB 诱导炎症的能力使其成为慢性炎症与癌症之间的关键联系之一[8]。

NF-κB 是一种重要的转录因子，它是由Rel 家族成员组成的二聚体蛋白，即P50/p105（NF-κB1）、p52/p100（NF-κB2）、p65（RelA）、RelB 和c-Rel[9]。NF-κB 信号通路通常通过两种主要途径：经典途径和非经典途径。经典通路的激活发生在许多刺激的下游，包括促炎因子IL-6、TNF-α 和整合素1，这些刺激通过不同的机制来诱导NF-κB 激活，包括泛素聚合物和信号蛋白复合物的形成，如IKK（IB 激酶）复合物。IKK 复合物包含3 个亚基，包括IKKα、IKKβ 和调节蛋白NEMO（或IKKγ），正常情况下，三者以1∶1∶2 的比例组合在一起[10]。IKKβ 激活依赖于激酶结构域的磷酸化，IKKβ 激活可以进一步磷酸化IκBα 并导致其降解，从而释放NF-κB（p65/p50亚单位）转移到细胞核，激活其转录靶点[11]，包括参与细胞氧化还原代谢及其调节的基因，以及那些促进癌细胞生存、增殖、上皮向间充质转化（EMT）和转移的基因[12]。NF-κB 通过影响具有癌症特征的基因的异常调节，在各种癌症中确立了促瘤作用。许多研究证实，通过基因消融或IKKβ 小分子抑制剂来抑制NF-κB 在体内具有抗炎和/或抗肿瘤作用[13]。IKKβ 缺陷小鼠在胚胎发育第13 天死亡，这是由于在肝脏发育过程中NF-κB 的TNF 信号转导缺陷导致严重的肝细胞凋亡而死亡[14]，这些结果表明IKKβ在NF-κB 信号转导中的重要作用。

NF-κB 在乳腺、肺、膀胱和卵巢癌中过表达。多项研究表明，NF-κB 通路在鼻咽癌细胞系和组织中过表达或激活[15]。NF-κB 信号系统可促成鼻咽癌的发生，其与EBV 感染和大量淋巴样浸润密切相关，潜伏膜蛋白1（LMP1）作为EBV 癌蛋白，是NF-κB信号传导的有效激活剂[16]，LMP1 可磷酸化IKK 复合物并诱导IКBα 降解，从而导致NF-κB 活化，NF-κB 的过表达进一步促进了肿瘤的发展[17]。Ki-67是一种仅在增殖细胞中表达的核蛋白，因此Ki-67标记指数反映了肿瘤细胞的增殖情况。研究证实，Ki-67 表达与乳腺癌和肺癌的侵袭性密切相关，而其他研究显示Ki-67 在鼻咽癌表达较高，Ki-67 表达与鼻咽癌的分期和预后有关，可作为预测鼻咽癌局部复发、转移和预后的有用指标[18]。本研究结果显示，IKKβ 和Ki-67 蛋白在鼻咽癌中的表达高于鼻咽炎组织，差异有统计学意义（P＜0.05），IKKβ 和Ki-67 蛋白的表达呈正相关，提示IKKβ 阳性表达的鼻咽癌增殖活性较高，预后较差；IKKβ 蛋白和mRNA 在不同肿瘤大小、淋巴结转移和TNM 分期中的相对表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。在肿瘤较大、有淋巴结转移和TNM 分期较高的鼻咽癌组织中IKKβ 蛋白和mRNA 的表达越高，NF-κBp65 和IKKβmRNA 的表达与鼻咽癌临床病理诸因素的关系密切；提示IKKβ 表达越高的鼻咽癌增殖速度越快，侵袭性越强，易发生转移，临床分期越晚，预后越差。NF-κB 通路可能参与鼻咽癌的发生和发展，IKKβ 过表达可能是判断鼻咽癌患者预后的独立因素。典型的NF-κB 通路对鼻咽癌的肿瘤发展和血管生成至关重要，提示NF-κB 通路可能是鼻咽癌潜在的治疗靶点[19]。IKKβ 是IKK 复合物的一个催化亚基，被认为是最有效和最具选择性的药物靶点之一，因为活化IKKβ 使IκB 磷酸化是IκBα 泛素化降解和NF-κB 释放到核的前提条件[20]，通过抑制其活性，达到抑制肿瘤细胞的耐药、提高抗肿瘤药物的敏感性、促进肿瘤细胞的凋亡等作用，从而提高抗肿瘤治疗的疗效[21]。

综上所述，IKKβ 与鼻咽癌的临床病理特征有关，其过度表达与预后不良有密切关系，提示IKKβ可能参与鼻咽癌的发生发展过程，IKKβ 高表达在鼻咽癌浸润转移中发挥重要的作用。