lncRNA-HMGCS1 的靶基因预测及信号通路富集分析

肖 杨，蒋 振

（川北医学院基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，四川 南充 637000）

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作用范围广、功能多未探索，近年来引起了广泛关注。研究发现，lncRNA 在多种疾病的发生发展过程中发挥着调控作用，其与多种疾病的发生发展及预后密切相关。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 合成酶1（HMGCS1）是甲羟戊酸（MVA）途径的限速酶，催化HMG-CoA 的合成，HMGCR 的底物是MVA 的中间体[1-4]。HMGCS 有两种亚型，细胞溶质HMGCS1和线粒体HMGCS2。研究发现[5，6]，HMGCS1 基因组扩增和突变涉及各种肿瘤类型，尤其是乳腺癌和肺癌。作为MVA 的中间体，HMG-CoA 也可以被HMGCl 催化产生酮体。HMGCS1 可通过HMGCL-乙酰乙酸轴增强BRAFV600E 依赖性MEK1 激活，从而促进BRAFV600E 阳性黑色素瘤的细胞增殖和肿瘤生长[7-10]。研究发现，甲羟戊酸（MVA）信号通路中的HMGCS1 在结肠癌组织中过表达，并正向调节细胞增殖及结肠癌细胞的迁移和侵袭。此外，HMGCS1 可增强PERK 的活性而不依赖于MVA 途径，抑制HMGCS1 可完全降低EGF 诱导的结肠癌细胞增殖[11-14]。然而，HMGCS1 在细胞内的作用及其在疾病发展中的作用仍不明确。为了全面阐明长链非编码RNA HMGCS1 在细胞内所调控的分子功能及生物学过程，本研究拟运用生物信息学方法，分析lncRNA-HMGCS1 在细胞内的调控靶基因及信号通路，并对其进行生物学功能注释，阐述lncRNAHMGCS1 在细胞内的功能作用和分子机制。

1 资料与方法

1.1 lncRNA-HMGCS1 靶基因预测 经NCBI 基因数据库查询lncRNA-HMGCS1 的序列，经miRDB 数据库（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测与lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作关系的miRNA，将miRDB 数据库预测到miRNA 与Starbase3.0数据库预测到的miRNA 选取2 个数据库的交集进行进一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因预测 在Starbase3.0 数据库中分别对这些miRNA 进行靶基因预测，选取预测程序个数为3，预测到靶基因的评分比较高的前5 个，通过David数据库（www.ncifcrf.gov）进行靶基因的GO 注释和信号通路富集分析。

1.3 GO 注释 在David 数据库中对选取的miRNAs靶基因结果进行功能注释（GO analysis），主要从基因功能的4 个方面进行：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）和信号通路（pathways）。得到具有统计学意义的GO 注释显著性分析（P≤0.05），同样信号通路富集分析阈值取P≤0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-HMGCS1 预测miRNAs 结果显示，在miRDB 数据库预测到与lncRNA-HMGCS1 有miRNA-lncRNA 互作关系的miRNAs95 个，Starbase3.0数据库预测到167 个；取两者交集共有14 个miRNA，是在Starbase3.0 数据库预测程序数为3 时能预测到靶基因的miRNA，具体如下：hsa-miR-543、hsamiR-429、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-496、hsa-miR-206、hsamiR-4735-3p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-2355-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-450b-5p。

2.2 GO 注释分析 选取其中评分较高的前2 个miRNA 进行靶基因预测，再运用数据库对结果中的靶基因进行GO 功能注释。结果显示，lncRNAHMGCS1 通过hsa-miR-543 作用的靶基因主要调控细胞内转运、内质网到高尔基复合体物质转运、调控细胞周期、染色质组装、细胞分裂以及蛋白质磷酸化等生物学过程；通过hsa-miR-543 作用的细胞内分子功能主要有转录调控区序列特异性DNA 结合、转录因子结合、转录协作因子活性、组蛋白结合、GDP 结合、GDP 结合、ATPase 结合及染色质结合等功能；长链非编码RNA HMGCS1 通过hsa-miR-429作用的靶基因主要调控细胞周期、凋亡过程、RNA剪接、细胞应对DNA 损伤反应、细胞内蛋白转运、细胞分裂、细胞内信号传导、蛋白磷酸化与去磷酸化、染色质重塑、蛋白质泛素化以及负性调控细胞增殖等生物学过程；通过hsa-miR-429 作用的细胞内分子功能主要有ATP 结合、泛素化蛋白连接酶活性、RNA 聚合酶Ⅱ序列特异性DNA 结合转录因子结合、PDZ 结构域结合、蛋白激酶活性、小GTPase 结合及序列特异性DNA 结合等分子功能，见图1。

图1 GO 注释分析

图1 GO 注释分析（续）

2.3 信号通路富集分析 选取评分较高的前2 个miRNA 进行信号通路富集，结果显示，长链非编码RNA HMGCS1 通过hsa-miR-543 作用的信号通路包括细胞衰老泛素化介导的蛋白质降解、昼夜节律、FoxO 信号途径、生长激素合成分泌和作用、TGFbeta 信号通路、人T 细胞白血病病毒1 感染、肿瘤信号通路、Kaposi 肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK 信号通路、VEGF 信号通路以及自噬信号通路等；长链非编码RNA HMGCS1 通过hsa-miR-429 作用的信号通路包括神经营养素信号通路、肿瘤中的糖蛋白信号通路、FoxO 信号通路、泛素介导的蛋白降解信号通路、Ras 信号通路、人乳头状瘤病毒感染、MAPK信号通路、细胞衰老以及自噬信号通路等，见图2。

图2 富集通路分析

3 讨论

HMGCS1 是甲羟戊酸途径中的一个潜在调节节点，在多种疾病中发生突变[15-18]，其表达在肿瘤中普遍失调。癌症基因组学数据集显示，HMGCS1 在胃癌、乳腺癌和肺癌等多种癌症中得到扩增，HMGCS1 可促进细胞增殖，如HMGCS1 介导的胆固醇生物合成促进结直肠癌细胞的增殖和生长。

HMGCS1 可通过HMGCL-乙酰乙酸轴增强，MEK1 的激活，从而促进黑色素瘤的细胞增殖和肿瘤生长，其在细胞生长、分化、个体发育等方面发挥重要作用[19-21]。本研究通过分析lncRNA-HMGCS1 的靶基因，并进一步分析其在细胞内调控的信号通路。

本次研究在miRDB 数据库预测到lncRNAHMGCS1 相关的miRNAs 共95 个，同时在Starbase3.0数据库预测到miRNAs 共167 个，取交集共得到14个miRNAs，分别是hsa-miR-543，hsa-miR-429，hsa-miR-200b-3p，hsa-miR-200c-3p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-496，hsa-miR-206，hsa-miR-4735-3p，hsa-miR-18b-5p，hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-2355-3p，hsa-miR-664b-3p，hsa-miR-579-3p，hsa-miR-450b-5p。对评分较高的前2 个miRNA 通过GO 功能注释发现，lncRNA-HMGCS1 通过hsa-miR-543主要调控细胞内物质转运，比如内质网到高尔基复合体物质转运。还调控细胞周期、染色质组装、细胞分裂以及蛋白质磷酸化等生物学过程。同时，作用的细胞内分子功能主要有转录调控区序列特异性DNA 结合、转录因子结合、转录协作因子活性及组蛋白结合等。此外，通过hsa-miR-429 的靶基因主要包括细胞应对DNA 损伤反应、细胞内蛋白转运、细胞分裂、细胞内信号传导、蛋白磷酸化与去磷酸化、染色质重塑、蛋白质泛素化，以及负性调控细胞增殖等生物学过程，表明其生物学功能主要跟细胞内的转录调控、转录因子结合及蛋白质结合密切相关。

进一步研究显示，lncRNA-HMGCS1 在细胞内作用的信号通路包括细胞衰老泛素化介导的蛋白质降解、昼夜节律、FoxO 信号途径、生长激素合成分泌和作用、TGF-beta 信号通路，提示它们的功能主要与细胞衰老、细胞节律、细胞长时程增强以及泛素介导的蛋白降解等方面相关。另一方面，通过hsamiR-429 作用的信号通路包括神经营养素信号通路、肿瘤中的糖蛋白信号通路、FoxO 信号通路、泛素介导的蛋白降解信号通路及Ras 信号通路等，提示其与细胞内的神经营养、肿瘤形成、蛋白降解等多种病理生理过程相关。然而，HMGCS1 的作用十分广泛，研究显示HMGCS1 可增强整合应激反应（ISR），并与内质网应激转导蛋白激酶RNA 样内质网激酶（PERK）相互作用，以代谢和非代谢方式促进胃癌的进展。

综上所述，lncRNA-HMGCS1 在细胞内调控的多个靶基因和信号通路，涉及到多种细胞内的生理和病理过程，与疾病的发生发展密切相关，长链非编码RNA-HMGCS1 是有潜力的疾病诊断或治疗靶点。