哮喘患儿外泌体中miR-7b水平及与肺功能的关系*

张艳萍，李 娜

内蒙古自治区鄂尔多斯市中心医院/内蒙古自治区超声影像研究所儿科,内蒙古鄂尔多斯 017010

哮喘是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的一类非特异性炎症，主要临床特征为可逆性气道阻塞、气道高反应性及气道炎症[1]。患者临床表现为反复咳嗽、气急、胸闷、喘息等，严重威胁患者生命健康[2-3]。流行病学资料显示，哮喘高发于儿童，且随着社会发展，儿童发病率呈逐年上升趋势[4-6]。目前，哮喘的总体控制率并不佳，探讨有效的生物标志物用于评估病情十分必要。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA 分子，主要通过抑制翻译或降解靶标信使RNA反应等过程从而调节机体基因表达。miRNA在细胞增殖、凋亡、分化等过程中发挥着重要作用[7-8]。研究证实，miRNA可参与气道变应性炎症的发病过程，在哮喘患儿支气管肺泡灌洗液中多种miRNA呈异常表达[9]。miR-7b是近年来引发关注的热点miRNA之一，其在炎性反应过程中发挥着关键作用，但关于哮喘患儿miR-7b表达的临床意义报道尚少。血清外泌体是一类直径为30～200 nm的脂质双层膜结构微小囊泡，在炎性反应、免疫监视等过程中起着重要作用，研究发现，血清外泌体存在丰富的特异性miRNA，且稳定性好[10]。基于此，本研究探讨了哮喘患儿外泌体中miR-7b水平及与肺功能的关系，并分析miR-7b在评估患者病情中的临床价值，旨在为哮喘患儿的临床治疗提供相关依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016-2021年本院收治的101例哮喘患儿为研究对象。哮喘诊断及分期参考《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[11]。根据患儿病情，将101例患儿分为急性发作期组(40例)和临床缓解期组(61例)，选择同期101例体检健康儿童为对照组。所有研究对象监护人知情且同意。本研究通过本院伦理委员会批准。哮喘患儿纳入标准：(1)年龄为6～12岁；(2)初次患病；(3)临床资料完整。哮喘患儿排除标准：(1)合并其他呼吸系统疾病；(2)合并心、肝、肾等其他器官组织疾病者；(3)有过敏性疾病史或哮喘家族史者；(4)近3个月内服用糖皮质激素等可能影响实验结局者。对照组纳入标准：(1)年龄为6～12岁；(2)近1个月内体检健康。

1.2方法

1.2.1外泌体提取 所有研究对象均于入组时空腹抽取静脉血5 mL，采用体液外泌体提取试剂盒(北京鼎国生物科技有限公司)提取血清外泌体：室温下静置静脉血30 min，随后以2 000×g离心10 min，取上层血清，经过0.22 μm过滤器过滤后，将500 μL血清与5 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)混匀，以100 000×g离心70 min，弃上清液后用PBS洗涤重悬，以100 000×g离心70 min后加入100 μL PBS重悬外泌体。

1.2.2RT-PCR检测 采用RNA提取试剂盒(美国Abcam公司)提取外泌体RNA，并根据逆转录试剂盒(美国Abcam公司)进行逆转录反应，根据SYBR RT-PCR试剂盒(中国杭州博日科技有限公司)说明书进行RT-PCR(TC100 PCR仪，美国Bio-Rad公司)实验。反应体系为：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环35 次。采用2-ΔΔCt法来测定各组miR-7b相对表达量，内参为U6，每个样本重复3次，取平均值。引物由中国北京鼎国生物科技有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3酶联免疫吸附试验(ELISA) 所有研究对象均于入组时空腹抽取静脉血5 mL，分离血清后采用ELISA(Hamilton microlab star 多功能酶标仪，瑞士Hamilton公司)检测白细胞介素(IL)-4、IL-6、γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白E(IgE)水平，试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2.4肺功能检测 所有研究对象均于入组时采用德国耶格MasterScreen IOS肺功能检测仪检测肺功能，包括第一秒用力呼气量(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC。

1.3观察指标 主要指标：(1)比较急性发作期组、临床缓解期组及对照组血清外泌体miR-7b、FVC、FEV1、FEV1/FVC水平；(2)分析哮喘患儿miR-7b水平与FVC、FEV1、FEV1/FVC的相关性；(3)分析miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平在患儿病情评估中的临床价值。次要指标：(1)比较急性发作期组、临床缓解期组及对照组血清IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平；(2)比较治疗前后哮喘患儿miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平；(3)分析哮喘患儿miR-7b水平与IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平的相关性。

2 结 果

2.1外泌体鉴定结果 通过透射电子显微镜可观察到血清外泌体呈圆形或椭圆形，见图1。

图1 透射电子显微镜下外泌体(标尺=100 nm)

2.23组一般资料比较 3组在年龄、性别构成及体质量等一般资料上差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3组一般资料比较(n或

2.33组miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平比较 相较于对照组，急性发作期组及临床缓解期组miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平更高，而IFN-γ水平更低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与临床缓解期组比较，急性发作期组患儿miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平有所上升，而IFN-γ水平有所下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平比较

2.43组肺功能水平比较 相较于对照组，急性发作期组及临床缓解期组FVC、FEV1、FEV1/FVC水平更低(P<0.05)；与临床缓解期组比较，急性发作期组患儿FVC、FEV1、FEV1/FVC有所下降(P<0.05)，见表4。

表4 3组肺功能水平比较

2.5哮喘患儿miR-7b水平与IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE及肺功能的相关性 相关性分析结果显示，哮喘患儿miR-7b水平与IL-4、IL-6、IgE水平呈正相关(r=0.345、0.392、0.496,P<0.05)，而与IFN-γ、FVC、FEV1、FEV1/FVC呈负相关(r=-0.383、-0.416、-0.452、-0.392,P<0.05)，见表5。

表5 哮喘患儿miR-7b水平与IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE及肺功能水平的相关性

2.6治疗前后哮喘患儿miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平变化情况 治疗后，哮喘患儿miR-7b、IL-4、IL-6、IgE水平有所下降，而IFN-γ水平有所上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 治疗前后哮喘患儿miR-7b、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平变化情况

2.7ROC曲线分析结果 IL-4的曲线下面积(AUC)为0.67，截断值为186.33 ng/L；IL-6的AUC为0.73，截断值为45.24 ng/L；INF-γ的AUC为0.77，截断值为48.37 ng/L；IgE的AUC为0.76，截断值为261.78 IU/mL；miR-7b的AUC为0.89，截断值为3.42；联合检测的AUC最大，为0.92。见表7。

表7 ROC曲线分析结果

3 讨 论

哮喘是我国常见的儿童慢性疾病之一，随着环境污染问题日益严重，我国哮喘患儿发病率快速上升，及时诊断及评估患儿病情十分重要[12-14]。目前，关于哮喘的发病机制尚不明确，有学者认为，辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2失衡在哮喘发生、发展过程中起着关键作用[1]。哮喘患儿免疫功能下降、外源性致敏原被抗原递呈细胞吞噬并促进T细胞的激活，导致大量炎性因子的释放，进而促使气道平滑肌收缩、气道壁细胞分泌物增多，最终引发临床症状[15]。此外，免疫功能下降还可促进Th2细胞活化，进而激活免疫细胞聚集，吞噬炎性细胞，同时释放大量炎性因子。本研究结果显示，相较于健康儿童，临床缓解期及急性发作期哮喘患儿IL-4、IL-6、IgE水平均有所上升，而IFN-γ水平有所下降，且急性发作期患儿IL-4、IL-6、IgE水平显著高于临床缓解期患儿，而IFN-γ水平显著低于临床缓解期患儿，且通过治疗后各指标水平均有所改善。这与既往研究结果较为一致，说明哮喘患儿存在炎性因子水平异常，且病情越严重患儿炎性因子表达异常程度也有所增加。

miRNAs是一类长度为17～25个核苷酸的非编码RNA，其不能编码蛋白质，主要作用机制为通过与靶基因的3′非翻译区相结合从而对靶基因的表达进行负反馈。近年来，随着研究的深入，已有大量研究证实miRNA在多种疾病的发生、发展过程中发挥着关键作用[16-17]。研究报道，miR-125b在哮喘患儿中呈异常表达，并与患儿病情严重程度密切相关，提示miRNA可作为诊断及鉴别哮喘的生物标志物之一[18]。miR-7b是近年来研究较为广泛的miRNA之一，在生物进化过程中高度保守，并高表达于血液系统。有研究发现，miR-7b可通过促进或抑制炎性因子的表达进而参与肺部炎性反应损伤及修复过程，因此推测miR-7b可能参与哮喘的发病过程[19]。血清外泌体可由免疫细胞、癌细胞等多种细胞分泌，包含蛋白质、核酸、脂质等成分。研究表明，外周血中的核酸序列容易受到外源物、核酶等物质的影响，导致RNA难以稳定存在于外周血中，而相较于外周血，外泌体的核酸序列具有较高的稳定性，且不易受到外界物质的干扰，已被医学研究者认为是诊断疾病的理想生物标志物之一[20]。本研究结果显示，相较于健康儿童，哮喘患儿血清外泌体miR-7b水平显著上升，且急性发作期患儿miR-7b水平显著高于临床缓解期患儿，而通过治疗后哮喘患儿miR-7b表达水平有所下降，这提示哮喘患儿存在miR-7b异常。肺功能指标FVC、FEV1、FEV1/FVC是评价哮喘严重程度及疗效的指标之一，研究发现，哮喘患儿存在FVC、FEV1、FEV1/FVC异常。而相关性分析结果显示，哮喘患儿miR-7b水平与IL-4、IL-6、IgE水平呈正相关，而与IFN-γ、FVC、FEV1、FEV1/FVC水平呈负相关。这也进一步说明miR-7b与哮喘患儿肺功能及炎性反应密切相关。

本研究进一步采用ROC曲线分析相关指标在患者病情评估中的临床价值，结果显示，IL-4、IL-6、IFN-γ、IgE水平单独评估患者病情的AUC均<0.80，且灵敏度及特异度不高。而miR-7b及联合检测评估患者病情的AUC均>0.80，且均具有较高的灵敏度及特异度，提示具有一定的临床价值。

但本研究也存在一定不足，如样本来源于单中心，导致样本量较小，可能导致结果出现一定偏倚。因此，仍需后续研究进一步加以探讨。

综上所述，哮喘患儿血清外泌体miR-7b水平显著上升，并与患儿炎性反应及肺功能密切相关。miR-7b水平在辅助评估哮喘患儿病情中具有一定的临床价值。