淀粉样纤维-阿魏酸水凝胶的制备及其性质

佘明汉，郑丽丽，艾斌凌，杨 旸，郑晓燕，校 导，蒋志国，盛占武,*

（1.海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院海口实验站，海口市香蕉生物学实验室，海南 海口 571101）

多酚是一类丰富存在于水果、蔬菜、绿茶和其他天然植物产品中的化学物质。阿魏酸（(E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯酸）因其结构中苯环上含有不饱和侧链、酚核、羟基和甲氧基，具有较强的生物活性，如抗氧化性、预防糖尿病、抗癌、神经保护和肺保护作用等。因此，阿魏酸在医药、食品领域具有潜在的应用前景。然而，由于阿魏酸稳定性差和生物利用度低，使其应用受到限制。针对上述问题，科学家们设计构筑了多种传递系统提高其稳定性和生物利用度，如天然多酚基涂层、纳米粒子、纳米胶囊和水凝胶等，多酚通过邻苯二酚和/或邻苯三酚等活性基团与蛋白大分子非共价结合形成的多酚-蛋白水凝胶，表现出良好的热稳定性、生物降解性、机械性能和组织黏附性而广泛受到关注。Yu Xiaoyue等利用表没食子儿茶素没食子酸酯和胶原蛋白纤维通过一系列非共价键交联制备的水凝胶，提高了表没食子儿茶素没食子酸酯的热稳定性。Zhong Yejun等利用热诱导乳清蛋白与葛根素通过氢键和疏水作用形成的水凝胶具有良好机械性能，有效保护葛根素的活性。然而，目前多酚-蛋白水凝胶存在负载率不高、载体蛋白对环境敏感、易被胃蛋白酶酶解消化等缺点，导致多酚的生物利用率低，阻碍了其高效利用和产业化应用。因此，开发天然、高效、稳定的递送体系，提升多酚的负载率、稳定性及生物利用率是目前的研究重点。

淀粉样纤维是蛋白质（如牛奶蛋白、鸡蛋蛋白、大豆蛋白）在低pH值（2～3）、低盐、加热（80～90 ℃）条件下形成的一种纳米长丝状蛋白，具有极大的长径比、很强的刚性和丰富的表面官能团，常被用于制备冷凝水凝胶的前体，具有更佳的水凝胶强度和断裂性能、保水能力和透明度以及更低的临界凝胶浓度，广泛用于高性能和功能化食品体系的构筑。多酚类小分子化合物能够通过疏水作用、π-π键共轭作用、氢键作用吸附到淀粉样纤维的表面，驱动纳米原纤维超分子自组装形成水凝胶，显著提高多酚化合物的负载能力和稳定性。将蛋白转化为淀粉样纤维后，蛋白结构发生变化，其结合能力明显增强，亲和常数显著增加。因此蛋白质纤维化对负载、保护和传递多酚具有极大潜能。

本研究将蛋白质纤维化改性形成淀粉样纤维后与阿魏酸结合形成水凝胶，通过单因素试验优化蛋白质量浓度、多酚添加量和反应pH值，以阿魏酸负载率为指标优化最佳制备条件，并考察水凝胶体系中阿魏酸在不同环境下的光、热稳定性。利用红外光谱、X射线衍射、扫描电镜表征其结构，通过内源荧光光谱、流变仪等探究水凝胶中蛋白质结构变化和凝胶性能，并采用体外模拟消化系统研究阿魏酸在淀粉样纤维水凝胶体系中的缓释性能和生物利用度。以期为多酚-蛋白水凝胶体系的构建提供新思路，为淀粉样纤维负载多酚提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

溶菌酶（BR，20 000 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；阿魏酸（纯度≥99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜、浓盐酸 西陇化工股份有限公司；甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

F-7000型荧光分光光度计 日本日立公司；UPLC I-Class型超高效液相色谱仪 美国Waters公司；RTOP-500Y智能光控制箱 浙江拓普云农科技公司；HAAKE RS600流变仪（配置温控循环系统） 德国Thermo Scientific公司；Vetex70傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉样纤维的制备

按照Hu Bing等的方法稍作修改，利用超纯水配制质量分数为10%的蛋清溶菌酶液。透析（7 000 Da）3 d去除杂质，每天更换一次水浴。透析后的溶菌酶液倒入锥形瓶中通过超纯水稀释成质量分数为2%的初始蛋白液，利用HCl（6 mol/L）调节pH值至2，放入恒温水浴搅拌器中，在90 ℃条件下通搅拌速率10 r/min处理8 h得到淀粉样纤维初始液，冷却到室温，放入-20 ℃冷冻24 h，再进行冷冻干燥，得到淀粉样纤维粉末，4 ℃条件下保存备用。

1.3.2 阿魏酸-淀粉样纤维水凝胶制备

配制不同pH值Bis-Tris（10 mmol/L）缓冲溶液，加入0.5%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），将一定量的阿魏酸加入其中，待完全溶解后加入1.3.1节淀粉样纤维粉末，置于45 ℃恒温培养箱中孵化15 h，形成阿魏酸-淀粉样纤维水凝胶。

1.3.3 阿魏酸的负载率

参照Alavi等的方法，将水凝胶样品置于10 倍体积（V）的无水乙醇中超声2 min，通过超高效液相色谱测量溶液中阿魏酸质量浓度（C），按式（1）计算负载率：

式中：W为水凝胶质量/g。

阿魏酸的色谱条件参照Ndolo等的方法，略有修改。BEH C色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：0.2%甲醇乙腈-0.1%甲酸（30∶70，V/V）；检测波长324 nm；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

1.3.4 单因素试验

按上述方法制备阿魏酸-淀粉样纤维水凝胶，调节pH值（4、4.5、5、5.5、6）、阿魏酸添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）和淀粉样纤维添加量（50、60、70、80、90 g/L）3 个因素的变化对负载率的影响。

1.3.5 稳定性

根据Yan Jun等的方法，测试其光稳定性。将1.3.4节负载率最高的水凝胶样品置于透明的培养皿中共5 组3 平行，放入智能光控制箱。25 ℃在光强0.35 W/m条件下照射，分别以特定的时刻（0、30、60、90、120 min）采集样品，按照1.3.3节的方法测试样品中阿魏酸的含量。根据Chen Shuai等的方法，测试水凝胶样品中阿魏酸的热稳定性。将1.3.4节负载率最高的水凝胶样品在30、40、60、70、80 ℃和90 ℃水浴中培养共42 组3 平行，分别在0、1、2、3、5、9 h和13 h时取样测试样品中阿魏酸含量。按式（2）、（3）计算降解速率常数（k）和半衰期（t），同时将阿魏酸单体（0.3%）作为对照组。

式中：C为阿魏酸的初始质量浓度/（mg/mL）；C为t时的质量浓度/（mg/mL）。

1.3.6 红外光谱

利用傅里叶变换红外光谱仪测定溶菌酶、淀粉样纤维以及水凝胶样品，将5 mg样品与95 mg KBr研磨混合压制成薄层，在4 000～400 cm的波数范围内分析，以4 cm的分辨率扫描64 次。

1.3.7 内源荧光光谱

根据Chen Hao等的方法，考察蛋白纤维化前后三级结构的变化。将溶菌酶、淀粉样纤维及水凝胶样品分别溶解于pH值为5的Bis-Tris（0.5% DMSO）溶液，最终质量浓度为70 g/L。用荧光分光光度计测定其内源荧光，激发波长为280 nm，发射波长为300～600 nm。狭缝宽度为10 nm。用pH 5.0的Bis-Tris缓冲液作为空白组。

1.3.8 扫描电镜

根据Yan Wenjia等的方法，将水凝胶样品在离子溅射机中镀金。用台式显微镜在5 kV加速电压下观察样品的微观结构。

1.3.9 X射线衍射

根据Jin Bei等的方法，用X射线衍射仪测试水凝胶样品的X射线衍射图谱。采用单色X射线束，Cu Kα辐射（λ=0.154 nm），采集5～50°范围内2θ数据。

1.3.10 凝胶性能

根据Hou Junjie等的方法，稍作修改。使用配备平行板（d=27.83 mm，1 mm间隙）和温度控制的循环系统的流变仪进行低振幅动态振荡测量。在凝胶过程中，以1 Hz的频率和0.5%的应变连续记录储能模量（G’）和损耗模量（G’）。测量温度为45 ℃，启动后13 h持续测量6 h。利用硅油覆盖样品的边缘，以避免在测量过程中水分蒸发。时间扫描流 变分析评估凝胶动力学。

1.3.11 溶胀性能

根据Yan Wenjia等的方法进行溶胀能力测试，稍作修改。将水凝胶样品放入滤布袋中（400 目滤布），将袋子在室温下完全浸泡在含0.02%叠氮化钠的500 mL蒸馏水中，定时更换蒸馏水，每1 h称量水凝胶样品的质量，直至水凝胶质量无明显变化。溶胀率按式（4）计算：

式中：W为水凝胶吸水溶胀后的质量/g；W为水凝胶的初始质量/g。

1.3.12 体外模拟消化

结合Chen Shuai和Yan Wenjia等方法进行体外模拟消化实验，并稍加改动。与9 倍体积的模拟胃液（SGF，主要成分为3.2 mg/mL胃蛋白酶和2.0 mg/mL NaCl）混合，用1.0 mol/L盐酸调节pH值至1.2。置于水浴振荡器（37.0 ℃、100 r/min），分别在30、60 min采集上清液，测试阿魏酸含量。将水凝胶样品取出置于9 倍体积的模拟肠液中（SIF，主要成分为2.0 mg/mL胰酶、12.0 mg/mL胆盐、8.8 mg/mL NaCl、6.8 mg/mL KHPO溶液），用1.0 mol/L氢氧化钠调节pH值至7.5。在水浴振荡器（37 ℃，100 r/min）中进一步消化，并在30、60、90 min和120 min采集上清液，测试阿魏酸含量。

1.4 数据处理

每组实验3 次重复，采用Origin 8.0和Heml等软件进行数据分析及作图处理，采用SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 单因素对负载率的影响Fig. 1 Effect of each independent variable on loading rate of ferulic acid

多酚的添加量、蛋白浓度及反应pH值是影响多酚-蛋白结合能力的重要因素，直接影响到多酚的负载率、水凝胶的形成及其结构和性能。从图1可以看出，随着阿魏酸添加量、淀粉样纤维添加量、pH值的增加，负载率出现先上升后下降的趋势。当阿魏酸添加量为0.6%、淀粉样纤维质量浓度为70 g/L、pH值为5时，负载率达到峰值6.99%。据报道，多酚可以沉积在淀粉样纤维纳米丝的表面沟槽中，并驱动其小分子自组装形成三维网络。阿魏酸添加量过低、淀粉样纤维添加量过高会导致大量淀粉样纤维相互络合形成聚合体，结合位点被阻挡，与阿魏酸的结合能力下降。相反，阿魏酸添加量过高、淀粉样纤维添加量过低时，结合位点出现饱和，导致淀粉样蛋白聚集能力下降，无法有效负载多酚小分子。由于pH值达到6.5时为淀粉样纤维的等电点，高于等电点水凝胶无法形成，所以本实验选取pH 4～6的范围。从图1c可以看出，pH值为5时负载率最高，偏高pH值的负载率普遍高于偏低的pH值。这可能由于多酚小分子在较低pH值环境中更加稳定，形成水凝胶所需的多酚量越少，导致负载率降低。

2.2 稳定性结果

2.2.1 热稳定性

图2 水凝胶样品中阿魏酸的热降解动力学（a～g）和光降解动力学（h）Fig. 2 Thermal degradation and photodegradation kinetics of ferulic acid-loaded hydrogel at different temperatures

表1 不同温度下负载前后阿魏酸的热降解参数Table 1 Thermal degradation parameters of ferulic acid and ferulic acid-loaded hydrogel at different temperatures

对水凝胶样品进行热降解动力学分析并与阿魏酸单体做对比，通过图2看出供试样品和阿魏酸单体的降解过程遵循一级反应动力学（R＞0.99）。如表1所示，半衰期（t）随着温度的升高而降低，消除常数（k）随着温度的升高而升高，t值越低、k值越高代表降解速率越快。说明阿魏酸的热稳定性随着温度的升高而降低。与阿魏酸单体相比，在90 ℃条件下样品的t值升高221.17%、k值降低68.85%。说明水凝胶有效降低了阿魏酸的降解速度，提升其热稳定性。

2.2.2 光稳定性

阿魏酸光稳定性差，与蛋白结合可提高其光稳定性。图2h表明阿魏酸的降解遵循一级反应动力学（R＞0.99）。如表2所示，与阿魏酸单体相比，在光照条件为0.35 W/m环境中，样品的t值升高125.00%、k值降低55.56%。说明淀粉样纤维-阿魏酸水凝胶可阻断或吸收大部分可见光/不可见光能量，提高了阿魏酸的光稳定性。

表2 负载前后阿魏酸的光降解参数Table 2 Photodegradation parameters of ferulic acid and ferulic acidloaded hydrogel

2.3 红外光谱

通过红外光谱进一步分析溶菌酶纤维化前后的结构变化，以及不同多酚添加量对蛋白二级结构的影响。酰胺I带（1 700～1 600 cm）被认为是定性和定量评价蛋白质二级结构最可靠的指标。1 650～1 670、1 600～1 640、1 680～1 685 cm和1 640～1 650 cm处的条带分别属于α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。通过Peakfit软件去卷积拟合得到的二级结构拟合如图3所示，结构占比如表3所示。溶菌酶纤维化形成淀粉样纤维后β-折叠占比由15.53%增加到34.99%，α-螺旋占比由21.53%增加到26.33%。研究发现，酸性条件下多酚优先与蛋白中的β-折叠结合位点相互作用，β-折叠占比增加提高了多酚的结合稳定性；而α-螺旋结构的增加有利于增加水凝胶中分子间排列的紧密程度，从而提高水凝胶的机械强度和缓释能力。另外，蛋白纤维化过程暴露出更多的表面结合位点，多酚可以通过疏水作用、π-π键共轭作用、氢键作用吸附到淀粉样纤维的表面，驱动纳米原纤维超分子自组装形成负载率高、结构稳定的水凝胶。因此，蛋白纤维化后对于负载多酚更具优势。从表3可以看出，当阿魏酸添加量为0.6%时，水凝胶中β-折叠和α-螺旋结构占比均达到最高，这种结构变化有利于负载多酚，提升多酚的负载率，这与单因素试验结果一致。

图3 蛋白酰胺I带拟合结果Fig. 3 Curve fitting of protein amide I bands

表3 溶菌酶、淀粉样纤维及阿魏酸-淀粉样纤维水凝胶中蛋白二级结构Table 3 Secondary structure composition of lysozyme, amyloid fibrils and ferulic acid-amyloid fibril hydrogels

2.4 内源荧光光谱

图4 溶菌酶、淀粉样纤维及水凝胶样品的内源荧光光谱Fig. 4 Endogenous fluorescence spectra of lysozyme, amyloid fibrils and hydrogel samples

通过分析内源性荧光光谱可以观测蛋白质的三级结构变化。如图4所示，经过纤维化处理后，蛋白的最大发射波长出现红移且荧光强度明显减弱，说明溶菌酶发生了展开/重折叠形成了聚集前体状态，与之带来的空间位阻遮挡住了蛋白中色氨酸的荧光信号，这与以往研究结果一致。淀粉样纤维与阿魏酸结合形成水凝胶后，最大发射波长继续红移，荧光强度发生小幅增强，说明多酚驱动纳米丝蛋白相互缠绕形成水凝胶，蛋白中色氨酸的延伸区暴露在极性更强的环境（水相）中。水结合到淀粉样蛋白-阿魏酸混合物表面可以进一步保护水凝胶中的多酚分子。多酚添加量对内源荧光强度影响较小。

2.5 水凝胶结构及溶胀性能

图5 水凝胶扫描电镜图Fig. 5 Scanning electron micrographs of hydrogels loaded with different amounts of ferulic acid

如图5所示，阿魏酸添加量不同导致水凝胶的微观结构也有所区别，当阿魏酸添加量0.4%时（图5a、b），水凝胶表面结构松散、不均匀并存在较大的沟壑和孔洞。阿魏酸的添加量为0.6%时（图5c、d），水凝胶表面结构存在有序排列，光滑紧密，无序排列结构也相对致密，无明显断层和孔洞，表面观察到细小白色颗粒。阿魏酸添加量为0.8%（图5e、f），结构均匀紧密，存在少量微孔，但无有序排列，进一步放大后（图5f）可观察到明显的不规则空洞和白色颗粒，白色颗粒可能是负载在淀粉样纤维表面的阿魏酸经过冻干形成的。综上，0.6%阿魏酸添加量与淀粉样纤维形成的水凝胶具有规整、致密的结构，有利于保持水凝胶的强度和稳定性。

图6 水凝胶的X射线衍射（a）、阿魏酸添加量（0.4%～0.6%）的水凝胶形成动力学（b）、阿魏酸添加量（0.7%～0.8%）的水凝胶形成动力学（c）和水凝胶溶胀率（d）Fig. 6 XRD pattern (a), formation kinetics (b, c) and swelling rate (d) of hydrogels loaded with different amounts of ferulic acid

如图6a所示，在21°处有一个宽峰，表明样品为非晶态。阿魏酸添加量的变化不影响峰位置，但影响峰强度，峰位置代表了结晶度大小，而峰强度与分子间排列的紧密程度呈正比，这表明阿魏酸添加量的改变不会改变水凝胶的结晶度，当阿魏酸添加量为0.6%时峰强度最大，说明此时形成的水凝胶分子间排列最为紧密。这与红外光谱、扫描电镜结果相互验证。

利用流变法进行低振幅振荡测量样品凝胶过程的储能模量（G’）和损耗模量（G’），当G’=G’时凝胶点出现，样品进入凝胶态。如图6b所示，阿魏酸添加量小于0.6%时，随着添加量的增大，凝胶点的出现更早，凝胶形成的更快，这时阿魏酸添加量与水凝胶的形成速率呈正相关，说明阿魏酸添加量的增加可以加快驱动淀粉样纤维形成水凝胶。当阿魏酸添加量大于0.6%时，如图6c所示，G’和G’未出现交叉点，根据宏观凝胶已经形成推测开始测量前已经达到凝胶点。结合单因素试验结果，凝胶形成过快不利于负载率的提高。凝胶体系稳定后的G’对应强度顺序为：0.6%组（1 655.50 Pa）＞0.7%组（1 205.43 Pa）＞0.8%组（551.06 Pa）＞0.5%组（440.88 Pa）＞0.4%组（280.26 Pa），G′越大代表水凝胶机械强度越大，这与X射线衍射结果一致。如图6d所示，0.4%组（186%）＞0.5%组（177%）＞0.8%组（170%）＞0.7%组（166%）＞0.6%组（160%），与流变学结果相反，说明水凝胶G’越大，溶胀能力越差。溶胀能力往往与分子间交联程度相关，交联程度越高，阻碍了水分子的扩散和渗透，溶胀能力减弱，低溶胀率可以延长活性物质的释放时间，这说明当阿魏酸添加量为0.6%时，水凝胶具有最低的溶胀率和良好的缓释潜能。

2.6 体外模拟消化

通过体外模拟胃液、肠液考察水凝胶样品的消化性能，结果如图7所示，0～60 min为胃液消化段，60～180 min为肠液消化段。阿魏酸添加量为0.6%时，在模拟胃液中释放率最低为25.55%，而阿魏酸的添加量增加至0.8%时，在胃液中释放率最大达41.61%，这可能是因为其中过量阿魏酸通过氢键结合在水凝胶表面，在酸性条件下迅速释放，不利于活性物质的保护。在整个模拟消化过程中，阿魏酸添加量为0.4%时，释放率最高为75.54%，这可能是因为其结构松散，溶胀率高，肠液体快速的扩散至水凝胶内部，促进活性物质的释放，这与Yan Wenjia等研究结果相似。而阿魏酸添加量在0.6%时，在肠液消化过程中释放率较高，说明水凝胶在胃液中可以有效保护活性物质进入肠液后释放，一方面是由于水凝胶结构致密而稳定，抵御胃液的水解和溶胀，另外一方面是由于阿魏酸小分子在较低pH值环境中更加稳定，水的结合保护了水凝胶中的活性物质，进入肠液后pH值升高，阿魏酸小分子开始活跃迅速释放。淀粉样纤维-阿魏酸水凝胶具有良好的缓释能力。

图7 不同阿魏酸添加量的水凝胶体外模拟消化Fig. 7 Simulated digestion characteristics of hydrogels loaded with different amounts of ferulic acid

3 结 论

将溶菌酶在酸性（pH 2）、加热（90 ℃）条件下纤维化改性形成淀粉样纤维作为蛋白载体，与阿魏酸自组装制备淀粉样纤维-阿魏酸水凝胶。当pH 5、淀粉样纤维添加量70 g/L、阿魏酸添加量0.6%时，阿魏酸的负载率达到最大（6.99%），较Hu Bing等研究结果（4.00%）提高了74.75%。此时水凝胶具有良好的光热稳定性、规整、致密的结构和最佳的凝胶性能，在体外模拟消化实验中表现出最佳的缓释能力。主要是由于溶菌酶纤维化形成淀粉样纤维后蛋白结构发生明显变化，β-折叠和α-螺旋占比分别增加了125.31%和22.29%，β-折叠的增加有利于结合多酚小分子形成稳定的水凝胶，提高多酚负载率；α-螺旋的增加有利于增加水凝胶分子间排列的紧密程度，提高水凝胶机械强度和缓释能力。综上所述，淀粉样纤维是一种极具潜力的蛋白载体，制备方法简单，可在多酚的递送体系构建方面发挥优势。本研究制备的淀粉样纤维-阿魏酸水凝胶对阿魏酸具有良好的负载和保护能力，有效提高了阿魏酸的稳定性和缓释能力。