HPLC法对不同厂家博落回注射液质量评价的研究

朱丽飞，陈 盼，赵玉丛，王笃学，李利红

(河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

博落回注射液是《兽药质量标准(2017年版)》中药卷中收录的制剂，为罂粟科植物博落回Macleayacordata(Willd.) R. Br.的果实经提取分离制成的生物碱硫酸盐灭菌水溶液[1]。博落回注射液含有多种异喹啉类生物碱[2]，具有抗菌消炎等功能，主要用于治疗仔猪白痢、黄痢等疾病[3-5]。目前，《兽药质量标准(2017年版)》主要采用薄层色谱法对博落回注射液中博落回总碱进行定性鉴别，采用紫外-可见分光光度法检查吸光度，要求吸光度不得低于0.55[1]，但是由于缺少含量测定项导致市售博落回注射液质量不一。血根碱和白屈菜红碱是博落回提取物中最主要的生物碱，也是博落回注射液中的主要有效成分。因此，本论文旨在以血根碱和白屈菜红碱为有效成分指标，建立HPLC同时测定博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的含量测定方法，以评价不同厂家博落回注射液的质量差异。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

甲醇购自天津市四友精细化学品有限公司；乙腈购自安徽天地高纯溶剂有限公司；磷酸、浓盐酸等购自天津市风船化学试剂有限公司；血根碱及白屈菜红碱对照品购自上海源叶生物科技有限公司；博落回注射液四批(规格5 mL)，分别购自吉林省华牧动物保健品有限公司(厂家A，批号20201104)、四川积善之家药业有限公司(厂家B，批号20201101)、山东圣旺药业有限公司(厂家C，批号20201101)、合肥强力动物药品有限责任公司(厂家D，批号20200902)。

1.2 主要仪器

E2695-Waters高效液相色谱仪购自沃特世科技上海有限公司；KQ-200KDE 超声波清洗机购自昆山市超声仪器有限公司；ESJ-S分析天平购自沈阳龙腾电子有限公司；SHZ-95B循环水多用真空泵购自巩义市予华仪器有限公司。

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters-symmetry C18(5 μm, 4.6×250 mm)；检测器为2489 UV-Vis，检测波长为270 nm；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，A∶B=25∶75；5～12 min，A∶B=60∶40；12～15 min，A∶B=25∶75；15～20 min，A∶B=25∶75)；流速为1.0 mL/min，进样量为5 μL,柱温为30 ℃。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液的制备

分别精密称量血根碱对照品9.90 mg、白屈菜红碱对照品11.70 mg于10 mL容量瓶中，加入1%盐酸-甲醇溶液(50∶50)4 mL，超声溶解，自然冷却后加上述溶液定容至10 mL，摇匀，分别制成每1 mL含血根碱0.99 mg的溶液和每1 mL含白屈菜红碱1.17 mg 的溶液作为对照品储备液。分别精密量取血根碱储备液0.5 mL、白屈菜红碱储备液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用1%盐酸-甲醇(50∶50)定容，作为混合对照品溶液(1 mL含血根碱49.5 μg、白屈菜红碱117 μg)。

1.4.2 供试品溶液的制备

分别精密量取不同厂家的博落回注射液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用1%盐酸-甲醇(50∶50)稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2 结果

2.1 系统适用性实验

分别精密吸取血根碱对照品溶液、白屈菜红碱对照品溶液、混合对照品溶液各5 μL，按照1.3所述的色谱条件进样测定，色谱图见图1～2，系统适用性结果如表1所示。结果表明血根碱保留时间约4.8 min，白屈菜红碱保留时间约7.3 min，供试品溶液中血根碱和白屈菜红碱的保留时间与对照品基本一致，且与相邻成分色谱峰完全分离(分离度>1.5)，理论塔板数以血根碱峰计算大于5 000。

表1 系统适用性实验结果

图1 混合对照品色谱图

2.2 线性关系考察

精密量取血根碱对照品储备液适量，通过逐步稀释配制成99.0、49.5、19.8、9.90、4.95、1.98 μg/mL的一系列血根碱对照品溶液。另精密量取白屈菜红碱对照品储备液适量，通过逐步稀释配制成117、58.5、23.4、11.7、5.85、2.34 μg/mL一系列白屈菜红碱对照品溶液。精密吸取各对照品溶液5 μL，在1.3色谱条件下进样测定，以峰面积A为纵坐标，分别以血根碱对照品浓度、白屈菜红碱对照品浓度c(μg/mL)为横坐标建立标准曲线。血根碱的回归方程为y=14258x-4574.6(R2=0.9978)，在1.98～99.0 μg/mL范围内线性关系良好；白屈菜红碱的回归方程为y=25895x-951.09(R2=0.9978)，在2.34～117 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 精密度实验

通过检测日内精密度和日间精密度评价仪器的精密度。取1.4.1混合对照品溶液，按照1.3色谱条件进行测定，日内精密度同一天连续进样6次，日间精密度连续3天每天连续进样3次，分别计算血根碱和白屈菜红碱峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果如表2～3所示。血根碱和白屈菜红碱的日内精密度RSD分别为0.18%、0.15%，血根碱和白屈菜红碱的日间精密度RSD分别为0.72%、0.32%，表明仪器精密度良好。

表2 日内精密度实验结果

表3 日间精密度实验结果

2.4 稳定性实验

取1.4.1混合对照品溶液，按1.3项色谱条件分别在1、2、4、12、24 h进样，记录不同时间血根碱和白屈菜红碱的峰面积，计算RSD，结果如表4所示，其中血根碱的RSD为0.44%(n=5)，白屈菜红碱的RSD为0.20%(n=5)，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

表4 稳定性实验结果

2.5 加样回收实验

精密量取厂家A博落回注射液9份，每份0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，分别按高(约150%)、中(约100%)、低(约50%)3个梯度加入血根碱对照品储备液(0.99 mg/mL)和白屈菜红碱对照品溶液(58.5 μg/mL)适量，每个梯度3份，用1%盐酸-甲醇(50∶50)稀释至刻度，摇匀，制备加样回收样品溶液，在使用1.3色谱条件进样测定，计算血根碱和白屈菜红碱的平均回收率和RSD值，结果如表5所示。血根碱的平均回收率(高、中、低)分别为103.01%、99.07%、100.82%，RSD值(高、中、低)分别为0.63%、1.80、1.15%；白屈菜红碱的平均回收率(高、低、中)分别为102.45%、99.09%、99.57%，RSD值(高、中、低)分别为0.59%、1.61%、2.21%，结果表明该方法准确度良好。

表5 加样回收实验结果

2.6 样品含量测定

将1.4.2配制的供试品溶液1.3项色谱条件进行测定，每个样品平行测定2次，记录峰面积，计算供试品溶液中血根碱和白屈菜红碱的浓度，结果如表6和图2～5所示。结果表明，厂家A博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的浓度分别为4.560、1.266 mg/mL，每支(5 mL)博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的含量分别为22.80、6.831 mg；厂家B博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的浓度分别为3.960、1.290 mg/mL，每支(5 mL)博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的含量分别为19.80、6.449 mg；而厂家C、D均未检出血根碱和白屈菜红碱。

图2 供试品溶液色谱图(厂家A)

表6 博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的确立

3.1.1 流动相和洗脱方式的选择

按照农村农业部第246号公告中博落回散质量标准的色谱条件[6]，以乙腈为流动相A、以0.2%三乙胺溶液(磷酸调节pH值至2.5)为流动相B进行梯度洗脱，结果血根碱和白屈菜红碱色谱峰均出现分叉。因此结合参考文献[7-9]，以乙腈为流动相A、0.1%磷酸溶液为流动相B，同时调节进样体积至5 μL，比较等度洗脱(A∶B=25∶75)和梯度洗脱(见1.3)的差异，发现等度洗脱时血根碱和白屈菜红碱峰峰形较宽，且白屈菜红碱出现分叉，而梯度洗脱时分叉现象消失，拖尾现象有所改善，但白屈菜红碱拖尾现象仍存在，且加入扫尾剂三乙胺拖尾现象并未改善。因此最终选择流动相和洗脱方式为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，A∶B=25∶75；5～12 min，A∶B=60∶40；12～15 min，A∶B=25∶75；15～20 min，A∶B=25∶75)。

图3 供试品溶液色谱图(厂家B)

图4 供试品溶液色谱图(厂家C)

图5 供试品溶液色谱图(厂家D)

3.1.2 波长的选择

根据参考文献[7, 9, 10]，HPLC法测定血根碱和白屈菜红碱的常用波长有270 nm和284 nm，经比较发现，血根碱和白屈菜红碱在270 nm的吸收值均比284 nm吸收值大，因此选择270 nm为检测波长。

3.2 博落回注射液质量差异分析

厂家A、B的博落回注射液中均能有效检出血根碱和白屈菜红碱，每支(5 mL)博落回注射液中两种有效成分总含量分别为29.63、26.25 mg，大于25 mg，满足说明书规格要求(5 mL∶25 mg)；而厂家C、D的博落回注射液中均不含血根碱和白屈菜红碱两种有效成分，且均检测出未知色谱峰(厂家C∶tR=5.558 min；厂家D∶tR=2.381 min)；表明厂家A、B的博落回注射液成分含量接近，而厂家C、D与厂家A、B的成分差异较大，说明目前市售博落回注射液质量差异较大。

目前《兽药质量标准》博落回注射液缺少含量测定项，无法统一进行评价，导致目前市售博落回注射液质量不一，存在以次充好的现象。本论文结合参考文献，通过反复优化色谱条件，建立了简单、稳定、准确的测定博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱含量的HPLC法，并且评价了四个厂家博落回注射液的质量，为博落回注射液质量标准的建立提供参考。