葛根素对肥胖相关基因NPY、POMC和NMU表达的影响

江道合，江青东

(1.河南正阳县畜牧技术服务中心，河南 正阳 463600； 河南牧业经济学院 畜产品质量安全技术研究院，河南 郑州 450046)

葛根素化学名为4,7-二羟基-8-β-D葡萄糖异黄酮，是从豆科植物野葛根中提取的单体,对动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、高血脂、高血压、糖尿病等疾病有一定的预防作用和治疗效果[1]。神经介素U受体对动物摄食和能量代谢具有重要的调节作用[2]。神经介素U主要分布在动物下丘脑腹内侧核和尾侧脑干区域，其受体主要分布在下丘脑的室旁核，这些区域是动物摄食和能量代谢的主要调控区[3]。通过对大鼠脑室注射神经介素U后可大大降低大鼠采食量并使其体重减轻，但对大鼠脑室注射神经介素U抗体后，大鼠采食量和体重都增加[3]。神经介素U受体基因敲除或封闭的大鼠，在自由采食的情况下，其体重也有所增加，表明神经介素U与其受体结合后，对动物采食和能量代谢具有调节作用[4,5]。本试验通过对肥胖大鼠下丘脑灌注葛根素，研究葛根素对神经介素U2受体基因(NMU2R)、神经介素U基因(NMU)、前皮质素原基因(POMC)、神经肽Y基因(NPY)等肥胖相关基因表达水平的影响，探讨葛根素的减肥机制。

1 试验材料与方法

1.1 主要试剂

葛根素由中国食品药品检定研究院提供。氯仿、乙酸钠、EDTA、琼脂糖等均购自武汉博士德生物工程有限公司。TRIZOL、100bp DNA Ladder、TaqDNA酶、MOPS、溴化乙锭、RNA酶抑制剂、MMLV反转录酶、Oligo (dT)、Taq聚合酶均购自Sigma公司。

1.2 主要仪器

DK-8D型电热恒温水槽、THZ-C型恒温振荡器、LG-微波炉、DYY-8型稳压稳流电泳仪、H6-1微型电泳槽、YXJ-2离心机均为格科微电子(上海)有限公司产品。Ferotec Gradien PCR基因扩增仪为Sigma公司产品。Rotor-Gene 3000 ReaLtime PCR仪为Corbett Research公司产品。凝胶成像系统为Gene Genius公司产品。U-3010紫外可见分光光度计为Hitachi公司产品。

1.3 试验动物及分组

选取体重250 g左右的SD雄性大鼠40只，随机分为4组：正常对照组、模型对照组(脑室注射生理盐水，5 μL/只)、低剂量葛根素组(脑室注射葛根素，5 μL/只)、高剂量葛根素组(脑室注射葛根素，10 μL/只)。鼠饲料由河南省实验动物中心提供，自由采食和饮水。试验期42天。

1.4 RNA提取与纯化

大鼠麻醉抽血后，快速取出脑组织并分离下丘脑，置于液氮中。取500 mg下丘脑组织于匀浆器中，然后加入5 mL TRIZOL进行匀浆，将匀浆后的样品吸入离心管中，置于恒温孵育箱中25 ℃孵育10 min，孵育后吸取1 mL匀浆液置入2.5 mL新离心管中，加入氯仿0.5 mL，剧烈振荡20 s，然后25 ℃孵育5 min，4 ℃ 12 000 g离心15 min，取上清液于2.5 mL离心管中，加入异丙醇1 mL，混匀后于25 ℃ 孵育10 min，4 ℃ 12 000 g离心10 min，弃上清，加入2.5 mL 75%乙醇，4 ℃ 7 500 g 离心8 min，弃上清。RNA沉淀在空气中干燥3 min。分光光度计检测RNA溶液的OD260/OD280。

凝胶电泳。称取2.5 g琼脂糖，溶于250 mL DEPC水中，加热至完全溶解，室温冷却。取10 mL 10×MOPS电泳缓冲液和20 mL甲醛溶液制胶，将制好的凝胶放入电泳槽内，加入足够量的电泳缓冲液。取100 μL RNA和400 μL甲醛，用配制好的EB溶液调配至终浓度(质量浓度)10 μg /mL，65 ℃孵育15 min，6 V/cm电压下电泳，紫外透射光拍照。

cDNA合成。取5 μL MMLV反转录酶、5 μL RNA酶抑制剂、20 μL 2.5 mM dNTP混合液、20 μL 5×RT缓冲液，混合均匀后37 ℃水浴10 min。取10 μL RNA、2 μL 3.5 μM Oligo(dT)引物、18 μL无RNA酶蒸馏水，混合均匀后65 ℃水浴6 min，37 ℃水浴10 min。取15 μL RT反应液和15 μL退火混合液于离心管中，36.5 ℃水浴56 min，95 ℃ 孵育6 min，4 ℃保存待用。

1.5 实时荧光PCR

β-actin:上游引物5′-CCTCTATGCCTCTATGCAACACAGC-3′，下游引物5′ -ATACTCCTGCTTGCTGCTGATGCC-3′。

NMU2R:上游引物5′-GCTTCCTCTTCTACATCTACCTCCA-3′，下游引物5′-CACAGCCACTCCCGTTGTCGCTC-3′。

cDNA合成。10×PCR缓冲液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL，20 μM的PCR特异引物1、引物2各0.5 μL，dNTPs混合液3 μL，Taq聚合酶3 U，cDNA 1 μL，加水至总体积25 μL。溶液混匀后，PCR循环45个(94 ℃ 20 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。将扩增后的PCR产物分别进行10倍梯度稀释成7个梯度浓度(1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7)的cDNA。

以7个梯度浓度的cDNA模板分别配制PCR反应体系。2.5 μL 10×PCR缓冲液，3 μL MgCl2溶液，3 μL dNTPs混合液，3 U Taq聚合酶，20 μM PCR特异引物1、2各0.5 μL，1 μL cDNA，加水至总体积为25 μL。溶液混匀后，5000 g离心30 s。

PCR扩增反应条件。β-actin：94 ℃ 5 min，35个PCR循环(94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)，87 ℃ 10 s。NMU2R：94 ℃ 5 min，35个PCR循环(94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s)，85 ℃ 10 s。

1.6 NMU、NPY及POMC基因表达的半定量PCR检测

(1)引物设计。β-actin:上游引物5′-CACCCGCGAGTACACACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACTCATCACACC-3′；POMC:上游引物5′-GAACAGCCCTTGAACTGAAAA-3′，下游引物5′-CTTGAAGAGCGTCAACCAGG-3′；NPY:上游引物5′-GCTGTGTGGAACTGACCCTCG-3′，下游引物5′-GGGACAGGCCAGACTGGTTTC-3′；NMU:上游引物5′-ATCTCCTCAATCCTGTCAACTGC-3′，下游引物5′-GTTGACCTCTATCCTCATTGCGT-3′。

(2)PCR扩增反应体系和反应条件分别如表1和表2所示。

表1 PCR扩增反应体系 μL

表2 反应条件

(3)目的基因表达量

用TAE×1配制1.2%琼脂糖凝胶，恒定电压90 V进行电泳。目的基因扩增产物灰度值/β-actin基因扩增产物灰度值为目的基因表达量。

2 结果

2.1 RNA提取

RNA凝胶电泳结果显示，18 S和28 S条带清晰、无降解(图1)，OD260/OD280比值为1.8～2.2，说明RNA纯度高。

图1 RNA凝胶电泳图

2.2 荧光定量PCR

图2、图3显示，NMU2R基因荧光定量PCR产物浓度高，PCR反应体系稳定、结果可靠。如表3所示，高剂量葛根素组NMU2R基因表达量显著高于正常对照组和模型对照组(P<0.05)，低剂量葛根素组NMU2R基因表达量高于高剂量葛根素组(P<0.05)。

表3 葛根素诱导下NMU2R表达变化

图2 NMU2R动力反应曲线

图3 β-actin基因动力反应曲线

2.3 半定量PCR

如图4所示，POMC、NPY、NMU等基因均得到很好的扩增。

图4 POMC、NPY、NMU基因扩增产物电泳图

如图5所示，NPY基因表达在葛根素的诱导下降低(P<0.05)，POMC和NMU基因表达在葛根素的诱导下增加(P<0.05)，说明葛根素的减肥机制与NPY、POMC的表达调控存在一定关联性。

图5 葛根素诱导POMC、NPY、NMU基因表达变化

3 讨论

下丘脑富含多种食欲因子，在调节饮食方面扮演着重要的角色。神经介素U存在于下丘脑室旁核的核团中，神经介素U与其受体结合，具有抑制食欲、增强能量代谢及减轻体重的作用。神经肽Y主要存在于下丘脑弓状核中，通过外源性注射神经肽Y可提高动物的摄食量，增加动物机体的脂肪蓄积[6-9]。NMU转基因小鼠下丘脑的POMC和NPY基因表达量显著增加[10]。

本试验中，葛根素给药后，下丘脑NMU2R基因表达量显著增加，葛根素低剂量组显著高于高剂量组(P<0.05)，表明低剂量葛根素对大鼠的减肥作用效果更好。本试验发现，葛根素干预组大鼠下丘脑中POMC基因表达量与NMU转基因小鼠下丘脑POMC基因表达量表现一致，均呈现高表达[11-15]。NPY基因表达则呈现下降趋势，这与NMU转基因小鼠的NPY基因表达相反，其原因可能是NMU2R基因被激活后，引起NPY及POMC基因表达变化，进而调节神经介素U2受体信号通路，使动物产生厌食反应。