猪OASL2基因克隆与序列分析

胡妍璇，杨佳纯，袁 帅，刘 洋，余金丽，程思贝，沙惠阳，赵孟孟

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528231)

先天性免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道屏障，是机体抵抗病毒和细菌感染以及激活获得性免疫的基础。病毒已进化出多种防御机制发挥免疫逃逸作用，从而抑制宿主的抗病毒反应[1,2]，寻求更加有效的抗病毒策略对于疾病的防控至关重要。干扰素(Interferon，IFN)作为一种重要的天然免疫分子，可通过诱导一系列信号通路激活干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表达。ISGs能够通过阻断病毒转录、降解病毒RNA、抑制蛋白翻译或改变蛋白功能来控制病毒复制的许多阶段，同时参与干扰素信号通路的免疫调节[7,8]。在主要的ISGs中，2′-5′寡腺苷酸合成酶(2′-5′ Oligoadenylate synthetase，OAS)是第一个被确定参与细胞固有抗病毒反应的细胞蛋白[5]，它参与细胞生长、分化、凋亡、基因调控等生物进程[6]，并且其胞内活性与IFN表达量相关[7]，在抗病毒感染中发挥重要作用。

OAS首先在干扰素处理后的人体细胞中被鉴定，之后小鼠、猪、牛和犬等哺乳动物体内的OAS也逐一被鉴定[8]。OAS可以分为OAS1、OAS2、OAS3和OASL四个家族成员，其中OAS1，OAS2，OAS3能催化三磷腺苷合成2′-5′寡腺苷酸(2′-5′ Oligoadenylates，2-5As)，2-5As作为第二信使激活核糖核酸内切酶(RNase L)通路抑制病毒复制和促进细胞凋亡[9]。OASL不具有2-5As合成酶活性，但可以利用其C终端串联的泛素样结构域(Ubiquitin-like，UBL)激活胞浆内RNA受体/感受器视黄酸诱导基因I(Retinoic-acid-inducible gene I，RIG-I)通路控制病毒感染[6]。OAS家族与许多慢性代谢性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的免疫调节相关[9,10]，例如OAS与I型糖尿病的发病相关[11]；OAS家族参与HIV-1感染的调控[12]；OASL可作为胰腺导管腺癌的预后生物标志物和治疗靶点[13]；OAS1和OAS3依赖RNase L途径抵抗登革热病毒感染[14]；OAS2对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的感染具有抑制作用[15]。因此，OAS具有广泛的抗病毒及免疫调节作用，进一步研究OAS在动物机体中的作用，将为动物疾病的防治与临床应用奠定基础。

OASL作为OAS的家族成员，在哺乳动物细胞中表现出抗病毒活性， OASL在大多数病毒感染后在细胞内上调并能显著抑制病毒复制[16]。人OASL依赖OASL/RIG-I途径抑制丙型肝炎病毒的复制[17]。OASL过表达能明显降低细胞内鸭坦布苏病毒的滴度[18]。猪OASL与增强IFN-I信号通路的黑色素瘤分化相关基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)互作从而抑制猪瘟病毒的复制[19]。猪OASL不依赖RNase L通路抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)的复制[20]。迄今为止，有关OASL功能的研究主要以人和鼠为模型[21]，仅有少数猪OASL基因的功能及作用机制被证实，而有关猪OASL2基因的克隆及鉴定未见报道。因此，本研究对猪OASL2基因进行克隆和序列分析，为后续深入研究猪OASL2基因的生物学功能以及抗病毒分子通路奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

猪肺泡巨噬细胞(PAMs)由本实验室保存；TRIzol Reagent试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒、2×TaqMaster Mix、DL10000 DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pCE2 TA/Blunt-Zero克隆载体、DH5α化学感受态细胞均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

参考GenBank数据库中OASL2序列，设计猪OASL2基因扩增引物。引物序列如下：上游引物OASL2-F：5′-ATGGAGCTATTTTAC-3′；下游引物OASL2-R：5′-TCAACCAGAACCAGGATG-3′，引物由广州天一辉远科技有限公司合成。

1.2.2 细胞总RNA提取

将PAMs培养液反复冻融3次，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，取上清液250 μL置于DEPC水处理过的1.5 mL灭菌离心管中，参照TRIzol Reagent RNA提取试剂盒说明书操作步骤，提取细胞总RNA。

1.2.3 cDNA合成

将提取的RNA进行反转录，获得猪OASL2基因cDNA片段，具体操作步骤参照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书，产物在-20 ℃条件下保存。

1.2.4 PCR扩增

将反转录后的cDNA进行PCR扩增，扩增体系为25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，模板cDNA 2 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 15 sec，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃充分延伸5 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶检测，电泳后分析凝胶成像结果。

1.2.5 猪OASL2基因的克隆与测序

回收目的片段，按照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒操作说明进行纯化，将纯化产物与pCE2 TA/Blunt-Zero载体连接，连接好的重组质粒转化到DH5α感受态细胞，转化菌经氨苄抗生素筛选后通过PCR技术鉴定，阳性菌液送至广州天一辉远生物科技有限公司测序。

1.2.6 猪OASL2基因序列分析

利用在线ExPASy Proteomic Server软件预测猪OASL2基因编码氨基酸的基本理化性质；参照GenBank数据库，采用DNA Star软件进行猪OASL2基因序列分析；利用MEGA 4.0软件构建系统进化树。参考序列信息见表1。

表1 参考序列信息

2 结果

2.1 PCR扩增

PCR扩增产物经1.0%琼脂凝胶电泳分离鉴定，在633 bp左右可见明亮的条带(图1)，条带大小与目的片段预期结果相符。测序结果显示猪OASL2基因编码区全长633 bp，表明该基因克隆成功。

M，DL10 000 DNA Marker；1，PCR扩增产物；2，菌液PCR结果

2.2 序列分析结果

2.2.1 碱基分布

猪OASL2基因序列全长633 bp，编码211个氨基酸，其中腺嘌呤138个，占总碱基数的21.80%；鸟嘌呤178个，占总碱基数的28.12%；胸腺嘧啶147个，占总碱基数的23.22%；胞嘧啶170个，占总碱基数的26.86%。

2.2.2 基本理化性质

猪OASL2基因相对分子质量为23.94 ku，理论等电点为8.160；强碱性(K，R)、强酸性(D，E)、疏水性(A、I、L、F、W、V)与极性(N、C、Q、S、T、Y)特性的氨基酸数量分别为27、24、81和46。

2.2.3 核苷酸及氨基酸相似性比对

运用MegAlign软件进行OASL序列相似性比对，核苷酸相似性比对结果显示(图2)，猪OASL2与猪OASL1相似性最高，为98.1%，与其它物种的核苷酸相似性为52.3%～72.0%；氨基酸相似性比对结果显示(图3)，猪OASL2与其它物种的氨基酸相似性为9.8%～58.1%，与猪OASL1相似性最高，为97.6%，与核苷酸相似性比对结果一致，说明猪OASL2基因在同一种属内保守度较高。

图2 核苷酸相似性比对

图3 氨基酸相似性比对

2.2.4 系统进化树分析

利用MEGA 4.0软件绘制猪OASL2基因系统进化树，结果显示：猪OASL2与猪OASL1位于同一进化分支，与相似性比对结果一致；与牛OASL在同一个亚分支，亲缘关系较近；与鸡、小鼠、大鼠的亲缘关系远。

2.2.5 氨基酸序列比对

通过MegAlign软件将16种OASL基因翻译为氨基酸进行多序列比对，分析结果显示各物种OASL基因编码的氨基酸序列长度不同，在不同的氨基酸位点存在缺失、插入及替换现象，提示抗原性存在差异(图5)。猪OASL2在N端有一个NTase结构域，此结构域发挥抗病毒功能，在C末端没有UBL结构域，但在NTase结构域中包含与其他OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位点LLRL，在N端的203个氨基酸与猪OASL1一致。

图4 OASL2基因系统进化树

图5 氨基酸序列比对

3 讨论

本试验成功从PAMs细胞中克隆猪OASL2基因，对不同物种OASL进行序列分析，结果显示猪OASL2与猪OASL1的核苷酸、氨基酸相似性最高，与系统进化树结果保持一致，证实该序列来源于猪体，说明猪OASL2在同一物种内具有较高保守性，与其它物种存在差异，提示猪OASL2的免疫学特性与其它物种存在差异。通过氨基酸序列比对发现，部分氨基酸位点发生变异，这一部分是否影响猪OASL2抗病毒效应还有待进一步研究。另外，猪OASL2包含一个N端NTase结构域，这一典型结构域在抗病毒效果中发挥重要作用[21]；在C末端没有UBL结构域，但在NTase结构域中包含与其他OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位点LLRL；在N端的203个氨基酸残基与猪OASL1一致。总之，对猪OASL2基因的生物学功能进行预测有利于揭示其可能参与的生物进程，为进一步研究猪OASL2基因参与抗病毒天然免疫提供理论依据。

OAS蛋白家族发挥抗病毒效应主要通过OAS/RNase L经典通路、RNase L非经典通路两种方式实现[22,23]，此外，OAS还可能利用多重途径发挥抗病毒效应。人OASL通过RIG-I信号通路实现抗病毒的方式已被证实[18]，人OASL通过C终端串联的UBL与RIG-I相互作用进而激活IFN-I通路发挥抗病毒效应[24]，说明C端的UBL在发挥抗病毒效应中起关键作用。通过氨基酸序列分析可知，猪OASL2基因提前表达终止密码子产生截短的OAS蛋白缺失C终端串联的UBL[25]，这有异于人OASL。因此，可以初步推断猪OASL与人OASL发挥抗病毒的作用机制存在差异。有研究报道猪OASL蛋白不具有酶活性和泛素样区域，但仍然具有较强的抗JEV活性，表明猪OASL2不是与RIG-I互作发挥抗病毒效应，而是通过其它途径来抵抗病原体感染，这在Helle Kristiansen[20]的研究中得到证实。此外有报道阐述OASL可以直接与MAD5以及环鸟苷酸-腺苷酸合成酶互作发挥抗病毒作用[19,26]。研究猪OASL2基因的遗传特性和免疫学特点，筛选猪OASL2基因抑制病毒的功能位点以及探索其抗病毒的分子机理将成为下一步研究的方向。

4 结论

猪OASL2基因CDS序列全长为633 bp，编码211个氨基酸，经序列分析发现，猪OASL2基因NTase结构域包含与其它OAS家族蛋白相同的P-loop、D-box以及保守位点LLRL。本试验结果为进一步研究猪OASL2基因的免疫学特点及抗病毒感染机制提供理论依据，也为后续开展对猪OASL基因家族组成、结构功能及其表达调控的相关研究奠定了基础。