基于单细胞RNA测序的胃癌淋巴转移的细胞学特征及分子机制研究*

邹媛远，黄 洋，周连帮

(安徽医科大学第二附属医院普外科，合肥 230601)

胃腺癌是一种起源于胃黏膜的恶性肿瘤,其最常见的转移方式是淋巴结转移，淋巴结转移与胃腺癌患者的治疗反应、局部复发和长期生存直接相关，不仅能够评价患者的预后，而且对于治疗模式的选择也是至关重要的[1]。单细胞RNA测序是一种在单细胞水平上对整个转录组进行扩增和测序的新技术。一些基于单细胞测序对胃癌的研究已经发表，但较少涉及与淋巴转移相关细胞学的研究[2-4]。本研究收集淋巴结转移阳性及阴性的胃腺癌组织及癌旁组织标本，采用单细胞测序技术进行分析，利用实时定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)技术对相关分子表达水平进行验证，旨在发现与胃癌淋巴转移有关的细胞学特征及分子改变，为胃癌的临床诊断和治疗提供了新的见解，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2019年9-12月本院接受胃切除手术的13例胃腺癌患者术中切除的肿瘤组织及癌旁组织，标本经病理检查确诊。患者术前未进行过放化疗,且对本研究均知情同意。单细胞RNA文库试剂盒均由南京新格元生物有限公司提供；SYBR®Green PCR(PowerTrackTMSYBR Green Master Mix)试剂盒、Trizol试剂购自美国Thermo Scientific有限公司。

1.2 方法

1.2.1分组

单细胞RNA测序：胃癌组织及癌旁组织根据淋巴结转移情况，分为4种类型，即N1、T1(无淋巴结转移的癌旁及肿瘤组织)，N2、T2(有淋巴结转移的癌旁及肿瘤组织)。RT-qPCR：胃癌标本13例依据术后病理结果分为淋巴结转移阳性组及淋巴结转移阴性组。

1.2.2单细胞RNA测序

按照试剂盒说明进行单细胞分离。利用Seurat程序进行细胞类型鉴定和聚类分析，将FindClusters函数的参数分辨率设置为0.6用于集群分析。使用功能FindMarkers对不同标本或连续聚类之间的差异表达基因进行鉴定。

1.2.3RT-qPCR检测XIST和CXCL5表达水平

提取胃癌组织按照试剂盒说明进行PCR，相对表达水平用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH为内参，XIST上游引物5′-TGG ATA GAG GAC CCA AGC GA-3′，下游引物5′-CAA GAC TGG CCC AGG CAT AA-3′；CXCL5上游引物5′-CAA GTT CCC TCC CCA CTC AC-3′，下游引物5′-TGC TAA AAA CCC GAC AGG CA-3′；内参GAPDH上游引物5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′，下游引物5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 胃腺癌中单细胞转录组图谱和不同细胞类型

分别从淋巴结转移阴性和阳性组的胃腺癌组织中获得1 461和2 951个单细胞转录本进行分析，共鉴定出10种主要细胞类型。与淋巴转移阴性组比较，淋巴转移阳性组的主细胞占比明显升高，见图1。

图1 胃腺癌中不同细胞类型占比

2.2 与胃癌转移相关的一种主细胞亚型

根据主细胞的转录谱自动聚类，主细胞亚聚类显示4簇，分别为主细胞1、主细胞2、主细胞3和主细胞4。采用拟时序分析法进行了转录轨迹分析，发现存在主细胞2、主细胞3、主细胞1向癌细胞的转录过渡状态。主细胞3在淋巴转移阳性患者的胃癌组织标本中明显富集，见图2。

A：主细胞亚聚类的比例；B：从主细胞到癌细胞的转化过程。

2.3 与胃癌转移相关的一种窝状黏液细胞亚型

窝状黏液细胞亚聚类为3簇，窝状黏液细胞1和窝状黏液细胞2主要存在于淋巴结转移阴性组的标本中，与肿瘤组织(T1)比较，在正常组织(N1)中含量略有增加。窝状黏液细胞3主要富集于淋巴结转移阳性组的标本中。使用受体-配体相互作用实现了细胞通信网络。在这个网络中，窝状黏液细胞3与癌细胞之间的相互作用最为明显。窝状黏液细胞3标记基因CXCL5在窝状黏液细胞3中特异性表达，见图3。

A：不同亚簇的窝状黏液细胞在标本中的比例；B：细胞通信网络；C：CXCL5在不同细胞类型中的表达情况；D：CXCL5在3个窝状黏液细胞亚簇中的表达情况。

2.4 淋巴结转移阳/阴性组胃癌组织XIST、CXCL5表达水平比较

RT-qPCR检测结果显示，淋巴结转移阳性组的胃癌组织中XIST、CXCL5表达水平均高于淋巴结转移阴性组(P<0.05)，见表1。

表1 淋巴结转移阳/阴性组胃癌组织XIST、CXCL5表达水平比较

3 讨 论

淋巴结转移是胃癌根治术后复发的最重要危险因素之一，淋巴结清扫已被证明可以提高胃癌的生存率[5]。单细胞RNA测序可以更好地揭示细胞之间的异质性，识别不同的细胞亚群，剖析细胞分化过程和细胞作用关系，目前，单细胞RNA测序在胃癌淋巴结转移中的研究鲜有报道。因此，将单细胞RNA测序技术应用于胃癌淋巴结转移探寻有关的细胞学特征和相关分子标志物等十分有必要。

本研究中发现了一种新的主细胞亚聚类——主细胞3，可能是胃腺癌转移的潜在标志。上皮化生是胃癌发生、发展的一个重要过程，主细胞的异常分化被认为是导致上皮化生的主要原因[6-7]。解痉多肽表达化生(spasmolytic polypeptide expressing metaplasia,SPEM)作为胃癌癌前病变，有报道称，发生化生时，主细胞会直接转化为SPEM细胞，而当化生消退时，SPEM细胞则会重新分化为主细胞[8]。本研究通过拟时序分析发现了在假的时间轴上，存在主细胞2、主细胞3、主细胞1向癌细胞的转化。本研究发现，主细胞2与正常主细胞标记基因类似，均高表达LIPF，而主细胞1和SPEM细胞相似，均高表达MUC6、SOX9[3]。作为正常的主细胞和SPEM细胞之间的中间状态，主细胞3仅在淋巴转移阳性患者的标本中明显富集，提示主细胞3可能是主细胞的一种新亚型，可以作为转移的标志。有了这个实验基础，继续对主细胞3的差异富集基因XIST进行RT-qPCR实验。XIST基因是哺乳动物中X基因失活的主调控因子，据报道，XIST在多种恶性肿瘤中过表达，并与更具有侵袭性的表型相关[9]。越来越多的研究表明，XIST异常上调与多种实体肿瘤的晚期肿瘤分期、分化差和生存期缩短直接相关[10]。整理文献发现，对XIST在胃癌淋巴结转移的研究鲜有报道。本课题组对XIST进行RT-qPCR，发现XIST在淋巴结转移阳性组的胃癌组织中表达水平更高，提示XIST过表达能够促进胃癌肿瘤细胞的淋巴结转移，从而提高肿瘤的恶性程度。

本研究发现窝状黏液细胞3主要存在于淋巴结转移阳性组的标本中，且在胃癌组织中明显富集，通过细胞互作分析发现其与癌细胞相互作用强烈。同时GO分析显示窝状黏液细胞3差异基因富集的信号通路很多与细胞分离、细胞迁移相关，如细胞骨架蛋白绑定、有丝分裂细胞周期、细胞分裂等[11-12]。对其差异基因进行分析，发现CXCL5为其标记基因。CXCL5是实体瘤中肿瘤微环境中重要的趋化因子之一，研究发现其来源可能与肿瘤微环境中的肿瘤自分泌和旁分泌有关[13]。根据以往的研究，与相应癌旁组织及正常组织比较，CXCL5在鼻咽癌、胃癌、结直肠癌等癌组织中表达水平明显升高[14-16]。本课题组对CXCL5进行RT-qPCR实验，发现CXCL5在淋巴结转移阳性组的胃癌组织中表达水平更高，提示CXCL5过表达能对胃癌肿瘤细胞的淋巴结转移有促进作用。

综上所述，本研究将单细胞RNA测序应用于胃癌淋巴转移，确定了两种可能对淋巴转移有促进作用的细胞类型——主细胞3和窝状黏液细胞3，并对这两种细胞类型进行差异基因鉴定，发现其标记基因XIST、CXCL5在淋巴结转移阳性患者的胃癌组织中明显高表达，提示主细胞3、窝状黏液细胞3及其标记基因XIST、CXCL5有望成为预测胃癌淋巴转移和治疗的分子生物标志物。