微柱凝胶法直接抗球蛋白试验IgG 型阳性质控品制作及临床应用

陈立龙，王厚芳，于俊峰

（1.北京和睦家京北妇儿医院检验科，北京 100101；2.北京和睦家医院检验科，北京 100015）

直接抗球蛋白试验（direct anti-globulin test，DAT），是用来检测红细胞（RBC）表面是否包被了免疫球蛋白或（和）补体的一项简易试验[1]。该试验主要用来辅助诊断迟发性溶血性输血反应[2]、自身免疫溶血性贫血（AIHA）[3-4]、胎儿和新生儿溶血症[5]、药物所致的免疫性溶血[6]等，应用十分广泛。

目前DAT 的检测方法主要有试管法、微柱凝胶法、U 型板法等。微柱凝胶技术具有敏感度高、操作简便、结果易判读的优点[7]；而且全自动仪器微柱凝胶法用于直接抗人球蛋白试验初筛具有操作标准化、结果清晰可保存、敏感度高的优点[8]，所以微柱凝胶法应用十分广泛。为保证DAT 结果的准确性，该试验需使用阳性质控品来验证阴性结果的有效性[9-10]。目前临床常用的DAT 检测类型主要包括单抗IgG 型和单抗C3d 型及二者的混合型（多特异度），可辅助临床诊断和治疗[11]。目前试管法与U 型板法有商品化的IgG 型阳性质控品，但尚无商品化的适合微柱凝胶法的质控品。因此，我们通过以下试验，探索制备应用于微柱凝胶法DAT 的IgG 型阳性质控品。

1 材料与方法

1.1 标本来源标本来自北京市通州区中心血站的O 型供者血袋所附血辫中的全血标本，标本符合无溶血、无异常凝集[12]，血浆部分无明显乳糜，采集时间为10 d 以内。留取血辫中全血标本，然后对标本进行多特异度（抗IgG&C3d） DAT 筛查试验，结果为阴性者可以使用。

1.2 试剂和仪器IgG 型抗D 试剂，上海血液生物医药有限公司，批次：20180626，测定抗体滴度为1∶256；DG Gel DC Scan 抗人球蛋白检测卡，简称Scan 卡（包含单抗IgG、单抗C3d、多特异度IgG&C3d），Diagnostic Grifols，S.A.公司，批次：18002.01；DG Gel Coombs 抗人球蛋白检测卡，简称Coombs 卡（只含有多特异度抗IgG&C3d），Diagnostic Grifols，S.A.公司，批次：18006.01；贝索配血专用离心机（台湾贝索，型号：2005-2）、GRIFOLS 配血专用离心机（Diagnostic Grifols，S.A.公司）、全自动配血及血型分析仪（Diagnostic Grifols，S.A. 公司，国械注进20183401737，型号：WADiana Compact）、加样枪、37 ℃水浴箱、4 ℃冰箱、一次性吸头、吸管、试管、低离子液、生理盐水等。

1.3 方法微柱凝胶法手工操作，严格按照Diagnostic Grifols，S.A.公司试剂说明书进行。全血标本1 000 r/min条件下离心3 min，取10 μL 压积红细胞到1 mL 配套低离子液（DG Gel Sol）中，配成1%红细胞悬液，混匀，取1%红细胞悬液50 μL 加到相应微孔管中，在GRIFOLS 配血专用离心机心后判读结果。结果判读，以红细胞留在微柱上端或分布在凝胶中为阳性[7]。

使用全自动配血及血型分析仪操作，严格按照仪器操作手册进行。全血标本1 000 g 离心3 min 后直接上机操作。结果判读，以红细胞留在微柱上端或分布在凝胶中为阳性[7]。

1.3.1 通过试验探索致敏红细胞的方法累计挑选2018年5 月至2020 年2 月北京和睦家医院血库收到来自血站的O 型Rh(D)抗原阴性献血员标本20 例，挑选O 型Rh(D)抗原阳性献血员标本20 例，每例2 mL 全血。每份标本中加入的IgG 型抗D 试剂400 μL，轻轻混匀，室温放置20 min，1 000 g 条件下离心3 min。然后使用两种抗球蛋白检测卡手工加样进行试验。Scan 卡（包含单抗IgG、单抗C3d、多特异度IgG&C3d）和Coombs 卡（只含有多特异度抗IgG&C3d）。

1.3.2 设计三组试验，筛选制作阳性质控品时最佳致敏条件（IgG 型抗D 试剂的最适加入量、最适反应温度、最适反应时间）

1.3.2.1IgG 型抗D 试剂最适加入量试验挑选Rh(D)抗原阳性标本20 例，每例2 mL 全血。把每例2 mL 全血平均分为10 份，每份0.2 mL。室温条件下，在每份0.2 mL标本中顺序加入IgG 型抗D 试剂5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL、20 μL 、25 μL 、30 μL、 35 μL、40 μL、 45μL；相当于每2.0 mL 标本对应加入IgG 型抗D 试剂50 μL、100 μL、125 μL、150 μL、200 μL 、250 μL 、300 μL、 350 μL、 400 μL、450 μL。然后轻轻混匀，放置20 min。1 000 g 条件下离心3 min。由于标本量较少，然后使用Coombs 卡手工加样进行试验。

1.3.2.2IgG 型抗D 试剂最适反应温度选择试验挑选Rh(D)抗原阳性标本20 例，对每份标本留取3 mL，再各自平均分为3 份，每份1.0 mL。把20 例标本的3 份样本，分别放置在4 ℃冰箱、室温（约25 ℃）、37 ℃温浴条件下1 h，然后在每份标本中各加入IgG 型抗D 试剂62.5 μL（相当于每2 mL 标本对应加入IgG 型抗D 试剂125 μL）。然后轻轻混匀，维持标本所处温度条件不变，放置20 min。1 000 g 条件下离心3 min。然后使用Coombs卡手工加样进行试验。

1.3.2.3IgG 型抗D 试剂最佳反应时间试验挑选Rh(D)抗原阳性标本20 例，每例2 mL 全血。室温条件下，在每例标本中各加入IgG 型抗D 试剂125 μL。然后轻轻混匀，1 000 g 条件下离心3 min。为保证反应时间准确，分别在反应时间（从加入IgG 型抗D 试剂算起）为5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、350 min，然后使用Coombs卡手工加样进行试验。

1.3.3 监测质控品的稳定性阴阳性质控品各20 例标本连续监测数据为北京和睦家京北妇儿医院2018 年5 月至2020 年9 月每天进行试验累计完成。使用全自动配血及血型分析仪[Diagnostic Grifols, S. A，国食药监械械（进）字2011 第3402485 号，型号：WADiana Compact GRIFOLS Compact，Coombs 卡]，进行DAT 阴阳性质控检测。

1.3.3.1监测阴性质控品的稳定性累计挑选2018 年5 月至2020 年9 月北京和睦家京北妇儿医院收到的来自血站的O 型献血员标本20 例，每例2.0 mL，不添加任何试剂，在1 000 g 条件下离心3 min 后，保存在2～8 ℃冰箱，作为阴性质控品。每天用全自动配血及血型分析仪（GRIFOLS Compact）进行多特异度（抗IgG&C3d）DAT 试验。做完后标本立刻放入冰箱。每天进行一次试验并进行连续监测，直到标本由于保存时间变长红细胞逐渐破坏，血浆层由清晰的黄色转为轻微红色时继续试验，出现严重红色时由于红细胞破碎导致出现拖尾现象时（结果+/-）终止试验。每次仪器做完后在阴性微孔中手工加入1%阳性质控品50 μL，离心后结果为阳性，说明阴性结果有效。

1.3.3.2监测阳性质控品的稳定性累计挑选2018 年5 月至2020 年9 月北京和睦家京北妇儿医院收到的来自血站的O 型Rh(D)抗原阳性标本20 例，每例2.0 mL。在每例标本中分别加入的IgG 型抗D 试剂125 μL，轻轻混匀，室温放置20 min，1 000 g 条件下离心3 min 后，作为阳性质控品。用全自动配血及血型分析仪（GRIFOLS Compact）进行多特异度（抗IgG&C3d）DAT 试验。每天进行一次试验连续监测，每次试验完毕标本放回2～8 ℃冰箱保存，连续监测60 d。血浆层由清晰的黄色转为轻微红色或加深时，仍继续试验至60 d。

2 结果

2.1 探索致敏红细胞方法的试验结果结果分析：①20份O 型Rh(D)抗原阴性标本，加入IgG 型抗D 试剂后，所有类型的DAT 结果全部为阴性；20 份O 型Rh(D)抗原阳性标本，加入IgG 型抗D 试剂后，单IgG 型和多特异度（抗IgG&C3d）DAT 结果全部为阳性，单C3d 型DAT结果全部为阴性，表明IgG 型抗D 试剂能够致敏Rh(D)抗原阳性的红细胞。使用IgG 型或含有IgG 型的直接抗球蛋白试剂检测时，DAT 结果全部阳性。②微柱凝胶法单抗IgG 型与多特异度（抗IgG&C3d）DAT 结果之间无试验准确性和凝集强度的差异，且致敏红细胞的是IgG 型抗D，与C3d 无关。所以后续试验均采用多特异度（抗IgG&C3d）微柱凝胶卡（即Coombs 卡），见表1。

表1 O 型Rh(D)抗原阴性和阳性各20 份标本加入IgG 型抗D试剂后的DAT 结果

2.2 设计三组试验，筛选最佳致敏条件包括IgG 型抗D 试剂的最适加入量、最适反应温度、最适反应时间。

2.2.1 20 例标本，按每2.0 mL 血标本加入IgG 型抗D 试剂量计算结果分析：参照汪德清和于洋编写的《输血相容性检测 试验室质量控制与管理》，凝集强度为3+是理想的质控品效果[12]。且IgG 抗体与RBC 表面的蛋白抗原反应，虽然不像IgM 抗体那样直接导致RBC 凝集，但是当抗体黏附于细胞时，RBC 细胞膜发生物理性改变，可导致阳离子渗透性异常，破坏RBC 稳定性[6]。所以制备凝集强度3+的阳性质控品时，微柱凝胶法每2 mL 全血标本加入IgG 型抗D 试剂最适当加入量选择125 μL，见表2。

表2 IgG 型抗D 试剂的最适加入量试验结果

2.2.2 选择最适反应温度的试验结果20 例标本，在4 ℃冰箱、室温（约25 ℃）、37 ℃温浴条件下，结果都是3+，无差异。虽然IgG 属于温抗体，最适反应条件为37 ℃。但该试验的结果表明：3 种温度下，反应20 min，制作的阳性质控品结果无差异。因此，为了方便，可以在室温条件下制作质控品，且使用前不需要先恢复至室温。质控品使用后要及时放回4 ℃冰箱保存。这样可降低细菌污染概率，利于长期保存使用。

2.2.3 选择最适最佳反应时间试验结果20 例标本，加入IgG 型抗D 试剂5 min 后，出现5 例3+w、15 例3+三种结果，可见并不稳定。加入IgG 型抗D 试剂10 min 及以后，10 例标本DAT 结果均为3+，试验结果能够达到比较稳定的状态。为了保证反应效果更加充分，在制作阳性质控品时，选择最佳反应时间为20 min。

2.3 监测质控品的稳定性

2.3.1 阴性质控品的稳定性20 例阴性质控品标本，DAT结果从阴性到由于红细胞逐渐破坏而出现拖尾现象，都分布在50～60 d 内。阴性标本结果能够稳定50 d 以上。有12 例标本在45 d 时标本上部血浆层出现轻微红色，但并不影响试验结果[13]。当出现严重红色时，说明红细胞破坏严重，结果出现拖尾现象后，不能继续使用。

2.3.2 阳性质控品的稳定性20 例阳性质控品标本，为期60 d 的连续监测DAT 结果，红细胞凝集强度都是3+。说明DAT 阳性质控结果在60 d 内稳定性良好。有10 例标本大约在45 d 时标本上部血浆层开始出现轻微红色，但并不影响试验结果[13]。有4 例标本在50 d 时转至红色，直到60 d 试验结束，试验结果都是3+，结果未受影响。

3 讨论

微柱凝胶试验明显不同于传统的试管法检测技术，微柱凝胶试验提供了一个清晰的凝集强度判断标准，各凝集强度之间可用肉眼鉴别，操作标准化，重复性好，试验结果清晰、稳定、客观，并可对结果进行拍照，存入计算机，作为资料保存。而传统的试管法，凝集强度的判定不易掌握，受主观因素影响较大，试验结果重复性不理想，且结果不可保存；微柱凝胶法不需洗涤受检细胞，敏感度高，对致敏红细胞检出率大大提高[14]，所以微柱凝胶法应用广泛。为了保证微柱凝胶试验的准确性，质控品的使用是十分必要的。

IgG 型抗体一般在体温条件下与RBC 表面的蛋白抗原反应，因此，将其称为“温凝集素”，IgG 型抗体很少直接导致RBC 凝集。IgG 型抗体引起的AIHA 原理比较复杂，简单描述如下：IgG 分子可能与RBC 表面的抗原和细胞毒细胞上的Fc 受体结合。通过免疫黏附（尤其是IgG-FcR介导的免疫黏附）可刺激一系列反应，导致吞噬作用，但发生反应需较长时间的相互作用。免疫黏附导致的吞噬作用可完全吞食靶RBC，通过内部的吞噬体破坏RBC。然而，这种吞噬常为部分吞噬，导致RBC 的表面积-体积比降低，使其变为球形红细胞。球形红细胞（由于其可变形性降低）无法穿过脾血窦壁上的小裂孔，因此在脾脏的Billroth 索中破坏[6]。血辫中的血为离开人体后的血液，不像人体中的血能在不断循环流动，所以被免疫黏附吞噬的几率很小，只是结合了IgG 抗体，而不引起破坏；另外，也不会再经过脾脏，所以能够被完整地保存下来，只呈现致敏的状态。所以制作的阳性质控品中与IgG 型抗体结合的红细胞可以保存较长的时间。

试验所用血液标本来自血站的血袋小辫，为带有保养液的全血标本。原因及注意事项如下：①标本容易得到，利用悬浮红细胞发出后的血袋剩余血辫标本就可完成；②作为献血员标本，在血站对传染病项目已做过双重检测，可最大限度的保证其制作和使用安全[15]；③另外血站对献血员做过贫血筛查，基本能够保证标本为正常的红细胞和血浆比例；④献血员全血标本中已经有适量的枸橼酸盐抗凝剂，磷酸盐缓冲液，为红细胞提供能量物质的葡萄糖和腺嘌呤等物质，有利于质控品的长期保存；⑤为减少细菌污染，标本保存在带帽的洁净无添加试管中；⑥对标本进行多特异度（抗IgG&C3d）DAT 筛查试验，结果为阴性者，可以使用；阳性者不能使用。因为据统计，在正常献血者中，Coombs 试验的阳性率为1∶36 000～1∶1 000[6]。另外，如果C3 也沉积于RBC 表面，那么IgG 抗体可固定补体，可加速标本溶血[6]。也有文献报道献血员DAT 阳性率为0.008%[16]。

综合以上试验及分析，得出适用于微住凝胶法IgG 型直接抗球蛋白试验质控品制作的步骤及注意事项：①选择标本：按照上文提到的试验标本筛选方法（来自血站O 型悬浮红细胞血袋的血辫10 d 内全血标本，无溶血、无异常凝集、多特异度DAT 筛查结果阴性）；Rh(D)抗原阳性的标本均为正常D。非正常D 抗原阳性标本不建议使用。②制作步骤：各试验室可根据需要选择是否配制阴性质控品。阴性质控品，选择Rh(D)抗原阳性或阴性的标本，留取2 mL 标本保存在带帽的无添加试管中。1 000 g 条件下离心3 min。阳性质控品，选择Rh(D)抗原阳性标本，留取2 mL 标本保存在带帽的无添加试管中。加入IgG 型抗D 试剂125 μL，混匀，室温放置20 min。1 000 g 条件下离心3 min。③制作完成后，使用常规检测方法连续检测3 次来确定相关靶值[12]：阴性质控红细胞凝集强度为0，阳性质控红细胞凝集强度为3+，且阳性质控日常使用中的强度偏差最多为1+。④有效期：阴性质控品的为45 d，阳性质控品为60 d。而且微住凝胶法使用质控品的量很少，如果每个月制作一次，可以满足日常工作需求。⑤质控品手工与上自动化仪器结果无差异，离心后可以应用在自动化仪器上，手工方法使用时需先配制成1%红细胞悬液。⑥质控品可直接应用在单抗IgG 型DAT 质控试验和作为多特异度（抗IgG&C3d）DAT 的参考质控品。⑦质控品保存在2～8 ℃冰箱，建议在有效期内使用。由于不受温度影响，所以使用前不必等标本恢复到室温。每次使用前要认真检查质控品外观，不能出现严重溶血，轻度溶血不影响试验结果[13]；每次使用前不需要重复混匀和离心，减少对红细胞的破坏；使用后及时放回2～8 ℃冰箱，降低细菌污染概率，利于其长期保存使用。⑧在制作和使用质控品过程中，要对质控标本按照具有潜在的传染物品对待。⑨各个试剂厂家的产品结果可能存在差异。如果应用其他厂家试剂，需要做验证试验。通过调整制作阳性质控品时IgG型抗D 试剂的加入量和验证靶值后再使用。

参照汪德清和于洋编写的《输血相容性检测 试验室质量控制与管理》，检验室制作的室内质控品保存期达到40 d 以上[12]。试验室自制的质控品保存期＞40 d，稳定性良好，所以可以满足日常使用。

在日常临床试验中，如果需要验证DAT 阴性结果的有效性，把阳性质控品配制成1%红细胞浓度，加入到试验结果阴性孔中离心即可。通常DAT 只需要阳性质控品，但是我们对自动化仪器进行室内质控时同时设置了阴性质控品，认为增加阴性质控也是有必要的[17]。

通过试验室较长时间的探索和完善，所制备的质控品可以满足日常DAT 试验室内质控的需求。同时，制备原料来源途径稳定、易得，而且选择的血液采集时间较短，可较大限度保证质控品的使用时间，减少制备次数[18]，有助于完善DAT 检测试验室的室内质量控制体系，适宜各试验室开展。各试验室可根据需要选择是否配制阴性质控品。