miR-216a-3p miR-128-3p通过调控RGS17抑制口腔鳞状细胞癌细胞表型恶化的机制研究

王 惠

(山东省济南市中医医院口腔科， 山东 济南 250012)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部癌症的主要组成部分，其5年生存率不足60%，严重威胁着人类的生命安全[1]。目前，OSCC的治疗依赖于手术切除、放化疗，但是对于处于晚期或复发的患者效果甚微。生物标志物是反映疾病进展过程中细胞生理变化的指标，可作为OSCC治疗的早期诊断或预后的指标。鉴于针对生物标志物的精准治疗在临床上的潜在应用，寻找特异性的OSCC标志物对患者预后具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是多种肿瘤的预后生物标志物，也是肿瘤新的潜在治疗靶点[2,3]。在OSCC中，部分miRNA的表达与患者的临床分期、淋巴结转移及存活率相联系，这些miRNA可作为OSCC的预后预测因子[4]。miR-216a-3p、miR-128-3p是最近几年新发现的OSCC失调miRNA，在OSCC的发生、发展中具有一定作用，但是其潜在的机制仍需继续研究。G蛋白信号调节器17(G protein signal regulator 17，RGS17)是一个癌基因，其在癌症发展过程中可能受多种miRNA的调控[5]。本研究旨在探究miR-216a-3p、miR-128-3p调控OSCC细胞表型恶化的机制与RGS17之间的关系。

1 材料与方法

1.1材料:样本来自2018年2月至2022年2月本医院行手术切除的OSCC患者36例，癌旁组织30例。其中癌组织包括Ⅰ期(7例)、Ⅱ期(17例)、Ⅲ期(12例)。所有患者均签署知情同意书。正常口腔角质形成细胞hNOK、OSCC癌细胞SCC-9、SCC-25、HN4均来自中国科学研究院上海细胞库；TRIzol试剂、Annexin-V/PI染色细胞凋亡检测试剂盒、购自美国Invitrogen公司；EdU细胞增殖试剂盒购自中国上海Beyotime公司；Transwell小室(孔径8-mm)购自美国康宁公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；PierceTM磁性 RNA-蛋白 Pull-Down 试剂盒、ECL检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养:hNOK、SCC-9、SCC-25、HN4细胞使用DMEM培养。用含10%的胎牛血清和1%抗生素的培养基培养。所有细胞均在5%CO2、37℃的条件下的恒温细胞培养箱中培养。

1.2.2转染与分组:使用脂质体3000转染试剂将mimic-NC组(转染mimic)、mimic-miR-216a-3p组(转染miR-216a-3p mimic)、mimic-miR-128-3p组(转染miR-128-3p mimic)、si-NC组(转染si-NC)、si-RGS17组(转染si-RGS17)、mimic-miR-216a-3p+pcDNA组(共转染miR-216a-3p mimic和pcDNA)、mimic-miR-216a-3p+pcDNA-RGS17组(共转染miR-216a-3p mimic和pcDNA-RGS17)、mimic-miR-128-3p+pcDNA组(共转染miR-128-3p mimic和pcDNA)、mimic-miR-128-3p+pcDNA-RGS17组(共转染miR-128-3p mimic和pcDNA-RGS17)转染SCC-9细胞，8h后更换新培养基继续养至48h，RT-qPCR检测转染效率。

1.2.3RT-qPCR实验:按照TRIzol试剂说明书从癌细胞或组织中提取总RNA，使用逆转录试剂盒将其合成cDNA。qPCR试剂盒检测cDNA中miR-216a-3p、miR-128-3p、RGS17的表达。

1.2.4EdU染色:按照EdU细胞增殖试剂盒说明书要求操作，PBS清洗细胞，用EdU溶液处理2h。甲醇固定细胞并用DAPI核染，在倒置显微镜下观察EdU阳性细胞。EdU阳性率(%)=EdU阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.5克隆形成实验:将细胞接种至6孔板培养14d。结果：形成的克隆细胞用甲醛固定、结晶紫染色。5min后，对含有50个以上细胞的菌落进行拍照、计数。

1.2.6Transwell实验:Transwell小室上室表面预先涂30μg Matrigel基质胶，用于细胞侵袭检测，使用不含基质胶的小室用于细胞的迁移检测。取100μL(1×105)细胞用无血清培养基混匀，加入上室。同时，在下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。37℃、5%CO2培养24h，侵入下室的细胞用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色。光学显微镜下拍照、计数。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡:用Annexin-V/PI染色法检测细胞凋亡。细胞在暗室中经过Annexin V-FITC、PI双重染色15min，然后上流式细胞仪检测分析细胞的凋亡情况。总凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.8双荧光素酶报告实验:化学合成野生型和突变miR-216a-3p、miR-128-3p结合位点的RGS17片段，插入pmirGLO双荧光素酶载体，构建RGS17-WT和SUDS3-MUT报告基因。然后，将上述构建物分别与miR-216a-3p、miR-128-3p模拟物或NC模拟物共转染SCC-9细胞。最后，通过双荧光素酶报告试剂盒检测细胞的荧光素酶相对活性。

1.2.9RNA沉降实验:使用PierceTM磁性RNA-蛋白Pull-Down试剂盒研究RNA下拉。首先，使用生物素RNA标记混合物和T7 RNA聚合酶，获得含有野生型、突变区域的RGS17-WT和SUDS3-MUT。随后，使用RIPA裂解缓冲液收集细胞裂解物并与miR-216a-3p、miR-128-3p模拟物或NC模拟物4℃孵育过夜。随后加入与链霉亲和素偶联的磁珠，以沉降生物素标记的RGS17及其相互作用的化合物。最后，使用qRT-PCR法检测各组化合物中的RNA的表达。

1.2.10WB实验:用SDS-PAGE凝胶电泳制备凝胶，蛋白电泳，硝化纤维素滤膜转移蛋白质。然后将膜与一抗(1000倍稀释的β-actin、RGS17)孵育过夜。再与二抗(500倍稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗)37℃孵育2h。ECL检测试剂盒对蛋白质条带显色，曝光。Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

2 结 果

2.1miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC组织、细胞中的表达:与癌旁组织相比，OSCC组织(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)中miR-216a-3p、miR-128-3p表达显著降低，SCC-9、SCC-25、HN4细胞miR-216a-3p、miR-128-3p表达显著低于hNOK(P<0.05)。见表1。

表1 miR-216a-3p miR-128-3p在OCSS中的表达

2.2miR-216a-3p、miR-128-3p对OSCC细胞恶性行为的影响:与mimic-NC组相比，mimic-miR-216a-3p、mimic-miR-128-3p组细胞miR-216a-3p、miR-128-3p表达显著升高，EdU阳性率、克隆形成率均显著降低，迁移细胞数、侵袭细胞数均显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 过表达miR-216a-3p miR-128-3p对SCC-9细胞增殖迁移侵袭的作用

2.3miR-216a-3p、miR-128-3p与RGS17的靶向关系:生物信息靶标预测网站发现，RGS17的3UTR存在连续的互补结合位点，如图1A、B。双荧光素酶报告实验显示，miR-216a-3p、miR-128-3p明显的抑制RGS17-WT细胞的荧光活性，如图1C；RIP实验显示，miR-216a-3p、miR-128-3p明显增加RGS17-WT细胞富集miR-216a-3p、miR-128-3p的能力，如图1D、E。过表达miR-216a-3p、miR-128-3p的细胞中RGS17蛋白的表达显著低于mimic-NC组，如图1F。在OSCC组织中RGS17表达水平与miR-216a-3p、miR-128-3p呈明显的负相关性，如图1G、H(P<0.05)。

图1 miR-216a-3p、miR-128-3p靶向RGS17

2.4RGS17在OSCC组织、细胞中的表达:GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析OSCC中RGS家族成员的表达，RGS4、RGS3、RGS19、RGS20在癌组织中的表达均显著升高。见表3。RGS17在OSCC组织(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和SCC-9、SCC-25、HN4细胞中的表达显著高于癌旁组织或hNOK细胞。见图2、表4。

表3 OSCC中RGS家族部分成员表达

表4 RGS17在OSCC组织细胞中的表达

图2 RGS17蛋白表达

2.5敲减RGS17对OSCC细胞恶性行为的影响:与si-NC组相比，si-RGS17组细胞RGS17表达显著降低(图3)，EdU阳性率、克隆形成率均显著降低，迁移细胞数、侵袭细胞数显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表5。

图3 RGS17蛋白表达

表5 敲减RGS17对SCC-9细胞增殖迁移侵袭的调控

2.6过表达RGS17部分逆转miR-216a-3p、miR-128-3p对OSCC细胞恶性行为的作用:与mimic-miR-216a-3p+pcDNA组相比，mimic-miR-216a-3p+ pcDNA-RGS17组细胞RGS17表达显著升高，EdU阳性率、克隆形成率、迁移侵袭细胞数均显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。与mimic-miR-128-3p+pcDNA组相比，mimic-miR-128-3p+pcDNA-RGS17组细胞RGS17表达显著升高(图4)，EdU阳性率、克隆形成率、迁移侵袭细胞数均显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表6。

表6 过表达RGS17部分逆转miR-216a-3p miR-128-3p对OSCC细胞恶性行为的调控

图4 RGS17蛋白图

3 讨 论

在OSCC组织和细胞中miR-216a-3p表达下调，且与OSCC患者的组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关，miR-216a-3p模拟物降低OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，增加细胞凋亡[6]。miR-216a-3p还可作为Circ 0011946、BCL2L2的靶标，发挥抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡的抑癌作用[7]。miR-128/MiR-142在口腔鳞癌组织和细胞中表达下调，miR-128/miR-142的过度表达抑制了OSCC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，并诱导细胞凋亡[8]。这说明了miR-216a-3p、miR-128在OSCC的恶化过程中具有关键作用。本研究发现，miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC组织、细胞中均下调，并与癌症分期相关。过表达miR-216a-3p、miR-128-3p表现出抑制OSCC细胞增殖、迁移侵袭，促进凋亡的作用，证实了miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC中的抗癌功能。深入研究，通过双荧光素酶报告实验和RNA沉降实验发现，RGS17是miR-216a-3p、miR-128-3p的共有靶基因，并且被miR-216a-3p、miR-128-3p负向调控，在癌组织中与miR-216a-3p、miR-128-3p呈负相关。这说明，RGS17可能与miR-216a-3p、miR-128-3p调控OSCC细胞恶性表型变化的因素之一。

RGS17的过度表达促进了多种癌症的发展[9]。RGS17在宫颈癌、卵巢癌、肺癌和肝癌中均表达上调，作为致癌基因参与癌症的恶化、肿瘤的生长[10，11]。RGS家族成员在OSCC中表达失调，不同成员发挥的功能各异。RGS12、RGS20在OSCC中具有抑制癌症进一步恶化的作用，其发挥作用的机制仍有待深入研究。而RGS17在OSCC中的作用及功能机制的研究仍处于初级阶段。本研究结果显示：头颈部鳞状细胞癌中RGS4、RGS3、RGS19、RGS20均高表达，RGS17在OSCC癌组织和癌细胞中表达也上调，这与RGS17在其他恶性实体瘤中的表达相一致。进一步敲减RGS17发现，OSCC细胞的增殖能力、迁移侵袭能力明显受到抑制，反而凋亡能力得到提升，呈现出抗癌治疗的效果，这说明了RGS17在OSCC中也发挥促癌的作用。为了进一步探究RGS17与miR-216a-3p、miR-128-3p之间的关系，通过共转染RGS17和miR-216a-3p、RGS17和miR-128-3p发现，过表达RGS17后，miR-216a-3p、miR-128-3p对OSCC细胞的表型恶化抑制作用受到明显的削减。

综上所述，miR-216a-3p、miR-128-3p抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移侵袭，促进凋亡，产生这种抗癌功能的潜在机制与直接靶向抑制RGS17有关，为OSCC的精准治疗提供新方向。不足之处在于这些实验结果尚未在动物体内得到进一步的验证，本课题组计划通过异种移植裸鼠成瘤观察miR-216a-3p和miR-128-3p对口腔鳞状细胞癌肿瘤生长、转移的调控。