hsa_circ_0044556通过miR145/PD-L1介导NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用

郑 文， 李 萌， 张艳丽， 禚金花， 戴永刚， 程世亮

(山东省立第三医院检验科， 山东 济南 250031)

近年来，肝癌的发病率呈现出逐年递增趋势，成为一种高死亡率的恶性肿瘤疾病[1]。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，在各类细胞中广泛表达，并对细胞的信号传导具有重要作用[2]。随着RNA测序技术的发展，越来越多的circRNA在癌组织中被发现。研究表明，circRNA通过影响肿瘤生长、迁移、侵袭和分化在癌症进展中发挥重要作用[3]。最近的研究发现hsa_circ_0044556还可以促进肝癌细胞增殖和恶化，可能成为肝癌治疗的潜在靶点[4]。然而，hsa_circ_0044556促进肝癌发展的作用机制尚不清楚。程序性死亡因子1(programmed death ligand 1,PD-1)/程序性死亡因子配体(programmed death ligand 1，PD-L1)信号通路可抑制T细胞的增殖与活化，是目前肿瘤免疫治疗的研究热点。而一些circRNA和miRNA可以通过干扰免疫攻击相关分子的表达影响癌症免疫监视和免疫逃逸。circRNA在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用，并调节免疫检查点基因从而影响免疫疗法的治疗效果[5]。本研究探究肝癌细胞表达的hsa_circ_0000190是否通过circRNA-miRNA-mRNA轴调节PD-L1表达参与免疫逃逸，为未来研究肝癌的免疫疗法提供参考价值。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验细胞：留取2018年6月至2021年3月于我院行肝癌切除术患者40例癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘≥5mm)标本100mg，液氮中保存备用。所有患者术前均未接受放化治疗，且签署知情同意书。

1.1.2实验试剂：正常肝上皮HL-02细胞、肝癌细胞系SMMC-7721、HCCLM3购自中科院上海细胞库；NK-92细胞购自上海泽叶生物科技有限公司；si-NC、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556、LipofectamineTM 2000 购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司；NK细胞杀伤活性检测试剂购于Promega公司；PD-L1抗体、GAPDH抗体购自英国abcam公司；PD-L1、hsa_circ_0044556、miR-145、GAPDH的qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方 法

1.2.1细胞培养：正常肝上皮HL-02细胞、SMMC-7721、HCCLM3肝癌细胞均使用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养，NK-92细胞培养于NK-92细胞专用培养基中，均置于37℃、5%CO2恒温的细胞培养箱中培养，根据细胞生长密度更换新鲜的培养基，待细胞生长到80%-90%时进行消化传代，取对数生长期的细胞进行的实验。

1.2.2hsa_circ_0044556、miR-145靶向性检测：利用TargetScan数据库和LncRNA2Target数据库预测hsa_circ_0044556、miR-145的靶基因。收集对数生长期的HCCLM3细胞接种至96孔板，根据LipofectamineTM 2000说明书进行转染，分别将hsa_circ_0044556 WT与hsa_circ_0044556 MUT及miR-145 mimic、miR-145-NC mimic转染至HCCLM3细胞中(同时miR-145 mimic、miR-145-NC mimic及 PD-L1-WT或 PD-L1-MUT共转染至HCCLM3细胞中)，48h后，应用双荧光素酶活性检测试剂盒检测HCCLM3细胞的荧光素酶活性。依据以下公式进行计算:相对luciferase活性=firefly luciferase活性/renilla luciferase活性×100%。

1.2.3NK细胞毒性试验：以培养24h后的NK-92细胞为效应细胞，以不同方式处理的肿瘤细胞为靶细胞，600r/min离心PBS洗涤2次，分别按2∶1、5∶1、10∶1效靶比加入96孔板，每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱培养3h。分别加10μL裂解液培养1h。加反应底物室温避光放置30min，加反应终止液终止反应，酶标仪测OD450nm值。NK-92细胞杀伤率(%)=(实验组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值-效应细胞自然释放组OD平均值)/(靶细胞最大释放组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值)×100%。

1.2.4细胞转染：将以3.5×106个对数生长期的HCCLM3细胞接种于6孔板中，待细胞生长密度至65%～75%时，分别转染si-NC、si-hsa_circ_0044556、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556+si-miR-145。分别设置为si-NC组(转染si-NC)、si-hsa_circ_0044556组(转染si-hsa_circ_0044556)、si-miR-145组(转染si-miR-145)和si-hsa_circ_0044556+si-miR-145(转染si-hsa_circ_0044556+si-miR-145)

1.2.5CCK8细胞增殖实验：取各组细胞，胰酶消化后离心，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释成单细胞悬液，以3×104个/mL密度接种到96孔板中，接种体积为200μL。在细胞培养箱中培养，在培养至24h、48h及72h时加入20μL CCK8检测试剂，1h后通过酶标仪测定450nm吸光度值。

1.2.6RT-qPCR法检测肿瘤组织或细胞中PD-L1、hsa_circ_0044556的表达：TRIzol试剂提取肝癌组织样本、正常肝上皮HL-02细胞、肝癌细胞株SMMC-7721、HCCLM3中的总RNA。按照qRT-PCR试剂盒实验说明，依次进行逆转录和qRT-PCR实验。扩增结果根据2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。引物序列：GAPDH-F，5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3，GAPDH-R，5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3；PD-L1-F，5-TTGCTGAACGCCCCATACAA-3，PD-L1-R，5-TGTCCCGTTCCAACACTGAG-3；miR-145-F，5-GTCCAGTTTTCCCAGGA-3，miR-145-R，5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3；hsa_circ_0044556-F，5-GAAGCTGGTCTGCCTGGTG-3,hsa_circ_0044556-R，5-GAGGAGCGAAAGGAAGGAGA-3。

1.2.7Western blot法检测肿瘤组织或细胞中PD-L1的表达：收集各组细胞，使用RIPA裂解提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白转至PVDF膜。5%脱脂牛奶4℃封闭1h，TBST洗膜5min，3次，加入GAPDH抗体(1∶4000)、PD-L1抗体(1∶2000)，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜5min，3次，加入HRP标记的羊抗兔的二抗(1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜5min，5次。显影曝光，利用Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1肝癌患者中hsa_circ_0044556和PD-L1的表达水平比较：qRT-PCR结果显示，与癌旁组织(1.00±0.42，1.00±0.54)相比，肿瘤组织中hsa_circ_0044556(7.03±3.26)和PD-L1(4.35±2.84)表达水平升高(P<0.05)，见图1A。通过Spearman进行相关性分析，结果显示，癌旁组织及肿瘤组织中hsa_circ_0044556和PD-L1的表达呈正相关(r=0.5481)，见图1B。

图1 肝癌中hsa_circ_0044556和PD-L1的表达水平呈正相关

2.2不同细胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表达水平比较：qRT-PCR结果显示，与正常肝上皮HL-02细胞(1.00±0.35，1.00±0.47)相比，肝癌SMMC-7721(4.74±1.64，2.25±0.85)、HCCLM3细胞(11.95±3.26，6.64±1.05)的hsa_circ_0044556和PD-L1表达水平升高(P<0.05)；与SMMC-7721细胞相比，HCCLM3细胞的hsa_circ_0044556和PD-L1表达水平升高(P<0.05)，见图2。后续选择肝癌HCCLM3细胞进行细胞实验。

图2 不同细胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表达水平比较

2.3hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145：预测结果显示，hsa_circ_0044556与miR-145的5’端存在多个连续匹配碱基对，见图3A。荧光素酶报告实验结果显示，转染miR-145模拟物和野生型hsa_circ_0044556的荧光素酶强度比转染miR-NC和野生型hsa_circ_0044556的降低(P<0.05)；这种现象在转染突变型hsa_circ_0044556后消失，见图3B。通过si-RNA沉默hsa_circ_0044556表达，与si-NC组(1.00±0.21)相比，si-hsa_circ_0044556组(2.13±0.68)miR-145表达水平升高(P<0.05)，见图3C。结果提示hsa_circ_0044556负调控miR-145表达。

图3 hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145

2.4miR-145靶向抑制PD-L1：预测结果显示，miR-145的5’端与PD-L1存在多个连续匹配碱基对，见图4A。荧光素酶报告实验结果显示，转染miR-145模拟物和野生型PD-L1的荧光素酶强度比转染miR-NC和野生型PD-L1的降低(P<0.05)；这种现象在转染突变型PD-L1后消失，见图4B。通过si-RNA沉默miR-145表达，与si-NC组(1.00±0.26)相比，miR-145组(2.96±0.34)PD-L1表达水平升高(P<0.05)，见图4C。结果提示miR-145负调控PD-L1表达。

图4 miR-145靶向抑制PD-L1

2.5hsa_circ_0044556通过miR-145影响PD-L1表达：Western blot结果显示，与si-NC组(0.82±0.13)相比，si-hsa_circ_0044556组(0.31±0.08)PD-L1表达降低，si-miR-145组(1.42±0.15)PD-L1表达升高(P<0.05)。与si-hsa_circ_0044556组相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145组(1.34±0.16)PD-L1表达升高(P<0.05)。与si-miR-145组相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145组PD-L1表达无显著性差异，见图5。结果提示，hsa_circ_0044556通过抑制miR-145的表达，间接调控PD-L1表达。

图5 沉默hsa_circ_0044556和miR-145对PD-L1表达影响

2.6hsa_circ_0044556通过miR-145影响肝癌细胞增殖和对NK细胞敏感性：CCK8实验和NK细胞毒性实验结果显示，与si-NC组相比，si-hsa_circ_0044556组细胞增殖能力降低，对NK细胞敏感性增加(P<0.05)；si-miR-145组细胞增殖能力升高，对NK细胞敏感性降低(P<0.05)。与si-hsa_circ_0044556组相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145组细胞增殖能力升高，对NK细胞敏感性降低(P<0.05)。与si-miR-145组相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145组细胞增殖能力和对NK细胞敏感性无显著性差异，见图6和表1。

表1 沉默hsa_circ_0044556和miR-145对NK细胞敏感性的影响

图6 沉默hsa_circ_0044556和miR-145对细胞增殖的影响

3 讨 论

世界卫生组织的数据显示，肝癌是全球第四大与癌症相关的死亡原因[6]。早期诊断可以显著改善肝癌患者的预后和生存率。然而，现临床研究中缺乏可靠的肝癌预后和复发的监测生物标志物。深入研究肝癌发生发展的病理机制，将为肝癌的诊治开辟新的思路和方法。

大多数circRNAs存在于细胞质中，在多种疾病中的发挥重要功能，包括肿瘤的发展、转移或预后有关[7]。在哺乳动物细胞中，与其他ncRNA相比，circRNA具有高度保守的序列和高稳定性，这些特征可能让circRNAs成为癌症理想的生物标志物和诊断的潜在靶点。hsa_circ_0044556由COL1A1基因(胶原蛋白，I型，Alpha 1)产生，位于17号染色体上，长度为200 bp。研究表明，hsa_circ_0044556在多种乳腺癌细胞中高表达，敲低其表达水平可显著抑制乳腺癌细胞的转移。此外，hsa_circ_0044556表达水平升高与患者较低的生存率相关[8]。本研究在肝癌细胞系和肝癌组织中均发现hsa_circ_0044556的表达水平升高，提示hsa_circ_0044556可能促进了肝癌的发展。

PD-1/PD-L1是重要的免疫检查点信号，受到人们越来越多的关注。近期研究表明，ncRNA参与了PD-1/PD-L1通路在癌变过程中的调控，其中circRNA介导的PD-1/PD-L1表达异常可能通过多种分子途径介导癌细胞的迁移和耐药性[9]。在本实验中，PD-L1在肝癌组织和肝癌细胞中高表达，且与hsa_circ_0044556呈现显著相关性，提示hsa_circ_0044556可能通过介导PD-L1的表达发挥作用。

miRNA是一组长短较短的非编码调控RNA，主要通过与3'-非翻译区(3'-UTR)互补结合在转录后调节基因表达。多种miRNA在人类恶性肿瘤中表达失调，其中miR-145被认为是致癌和治疗耐药性的关键抑制因子[10]。本研究发现hsa_circ_0044556负调控miR-145表达，miR-145负调控PD-L1表达，hsa_circ_0044556通过抑制miR-145的表达，间接调控PD-L1表达。NK细胞在对癌症的免疫反应中起关键作用，肿瘤细胞则可以利用肿瘤微环境中多种因素逃逸NK细胞的免疫监视。在本实验中，si-hsa_circ_0044556组肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性明显增加，而si-hsa_circ_0044556+si-miR-145组细胞增殖能力升高，对NK细胞敏感性降低，hsa_circ_0044556通过miR-145影响肝癌细胞增殖和对NK细胞敏感性。

综上所述，hsa_circ_0044556和PD-L1在肝癌患者组织和肝癌细胞系中呈现高表达且具呈正相关，hsa_circ_0044556通过miR145/PD-L1信号轴促进肝癌细胞增殖的同时抑制对NK细胞杀伤的敏感性，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸。