EMS诱变对不同基因型胡麻种子萌发及M3农艺性状和品质性状的影响

王 斌,赵 利,侯静静

(甘肃省农业科学院 作物研究所,兰州 730070)

胡麻,也叫油用亚麻,是中国西北和华北地区重要的油料作物之一。亚麻籽中含有的木酚素、脂质、蛋白质、膳食纤维和微量营养元素,亚麻籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸,具有预防和治疗心脑血管、糖尿病,提高免疫力、抗癌和抗氧化等生理功能,具有极高的营养价值和医疗保健功能[1]。2019年中国亚麻种植面积23.3 万hm2,亚麻总产量为34万t,但进口的亚麻籽总量达到42.7万t,亚麻籽进口量已远远超过国内产量[2]。随着人们健康意识的提高,对亚麻籽功能活性成分在营养保健和医药等领域的深入研究,胡麻籽的市场需求会持续增长。亚麻主要种植在高寒干旱地区,产量低,农民种植积极性不高。应该针对不同用途选育适合深加工的优良品种,增加其经济附加值。但是胡麻种质资源遗传基础狭窄,国内胡麻育种长期使用骨干亲本使得品种遗传多样性较低,品种选育难以取得较大的突破[3]。

通过化学剂诱导作物可以产生大量变异性状,比常规杂交育种效率高,选择生产上可利用的性状和基因,具有独特的优势。EMS(Ethyl methane sulfonate,甲基磺酸乙酯)是一种高效、稳定和良好的化学诱变剂,诱变效果好,目前在花生[4]、大豆[5]、油菜[6]等油料作物上广泛应用。EMS化学诱变通常诱发C/G 到T/A 转换的点突变,主要是将DNA 鸟嘌呤的N7 位置烷基化[7],出现鸟嘌呤N7 烷基活化,糖苷键断裂脱去鸟嘌呤,导致基因复制时碱基错位,产生突变,或者是烷基化的鸟嘌呤和胸腺嘧啶配对,产生突变,最终引发基因突变。EMS具有诱变效率高、材料损伤较小及适用范围广等优点。利用EMS 诱变构建突变体库已成为获得突变体、创新种质和育种的有效手段[8]。于莹等[9]在亚麻上研究表明,高浓度EMS诱变亚麻成苗率较高,但大多数是不育植株,导致种子产量较低。EMS 诱变在胡麻的报道较少,本研究设置不同诱变浓度和时间,探讨EMS诱变对不同基因型胡麻品种的诱变效应,并对M3种子的农艺性状和品质性状进行分析,为胡麻新品种选育和遗传改良提供优异资源。

1 材料与方法

1.1 材料

供试验的胡麻品种为‘轮选3 号’‘CDC SoRel’‘张亚2号’‘C9625’和‘内亚6号’共5个品种,其中‘轮选3号’‘CDC SoRel’‘C9625’籽粒颜色为褐色,‘张亚2号’和‘内亚6号’籽粒颜色为浅黄色,由甘肃省农业科学院作物研究所提供。

1.2 主要试剂及药品配置

化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS),购自Sigma公司。配置0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液,然后调试p H 至7.0。将磷酸盐缓冲液作为溶剂,配制0(CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%的EMS溶液(V/V),现配现用。

1.3 试验设计及处理

试验设5个品种(A)、4个处理时间(B)、和5个诱变浓度(C),因素及水平如表1 所示。试验共20个处理,以磷酸盐缓冲液为对照(CK)。每份材料选取饱满种子1 000粒置于培养皿中,在通风橱中按不同处理进行浸种,然后用无菌水冲洗种子10次。上述处理后得到的种子为M0,将M0种子30粒于双层滤纸的培养皿中发芽,统计发芽率。

表1 试验因素与水平Table 1 Experiments factors and levels

M0种子于2017年播种于甘肃省农业科学院兰州试验地,每个处理种两行,行长2 m,每行播种300粒。田间调查出苗期,出苗后分2次调查并(间隔1 周)统计出苗率。M1 种子于2018年在甘肃省农业科学院兰州试验地按单株编号的顺序全部播种;M2种子当年进行南繁加代,按编号每个材料种1 行。M3 种子于2019 年在甘肃省景泰县按行播种,每个处理取20株进行考种,考察株高、工艺长度、分茎数、分枝数、单株果数、千粒质量、单株产量;利用瑞士Perten公司生产的DA 7200型近红外品质分析仪,进行品质成分分析,测定指标包括粗脂肪含量、脂肪酸组分(主要为棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油酸)和木酚素含量。

发芽率=第7天发芽的种子数/总种子数×100%

出苗率=出苗数/播种的种子数×100%

相对出苗率=出苗率/对照的出苗率×100%

1.4 数据处理

采用Excel 2010和DPS 7.5软件对数据进行统计分析。用单因素试验统计分析方法,对胡麻不同处理的试验数据进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对不同基因型胡麻种子发芽率的影响

由图1 可见,随着EMS 处理浓度的增加和时间的延长,‘轮选3号’发芽率由最高93.33%降到最低51.11%,‘CDC SoRel’和‘C9625’由最高91.11%降到最低71.67%和72.22%,‘内亚6号’由最高85.56%降到最低37.38%,‘张亚2号’由最高67.78%降到最低4.44%,变化趋势基本都是由高到低。在不同品种间,尤其是不同籽粒颜色的品种间,EMS处理对发芽率的影响存在显著差异。对籽粒颜色褐色的品种‘轮选3 号’‘CDC So Rel’‘C9625’发芽率影响,在不同浓度和时间处理下,发芽率呈缓慢下降趋势,而对浅黄色品种‘张亚2号’和‘内亚6号’的发芽率影响,呈快速下降趋势。‘张亚2 号’对EMS 处理最敏感,其次是‘内亚6号’,‘轮选3号’最不敏感。

图1 EMS处理不同基因型胡麻种子发芽率Fig.1 Seed germination rate of different flax varieties under EMS treatment

2.2 EMS处理对不同基因型胡麻相对出苗率的影响

EMS诱变剂损伤种子活力,抑制萌发;处理时间越长,诱变浓度越高,相对田间出苗率越低;同一浓度水平上处理时间越长,同一时间水平上诱变浓度越高,田间相对出苗率越低(表2)。EMS处理对不同品种相对出苗率的影响存在显著差异,在不同品种间、不同处理时间和不同处理浓度下均呈显著差异(P＜0.05)(表2)。不同品种间,‘轮选3号’相对出苗率高于其他品种,其次是‘CDC So Rel’和‘C9625’,而‘内亚6号’‘张亚2号’相对出苗率最差。‘CDC So Rel’和‘C9625’在处理B3C4、B3C5、B4C4、B4C5基本没有出苗,而敏感品种‘张亚2号’‘内亚6号’在浓度较高和 处理时间较长的情况下,基本没有出苗。

表2 EMS处理不同基因型胡麻品种相对出苗率Table 2 Relative emergence rate of different flax varieties under EMS treatment

为了研究不同基因型胡麻品种、EMS处理时间和浓度3因素对胡麻相对出苗率的影响,进行了方差分析和多重比较。由表2可知,品种、处理时间、浓度、品种×时间、品种×浓度、时间×浓度、品种×时间×浓度的F 值均达到显著水平(P＜0.01),说明每个因素对相对出苗率的影响都是显著的,不同品种、浓度和时间存在交互作用。而不同基因型的品种,在同样的浓度和时间水平下出苗率也是显著变化的。可见,不同基因型的胡麻品种对EMS诱变的响应是不同的。从平方和占比可知,对相对出苗率影响最大的因素是品种,其次是处理浓度和处理时间。

2.3 EMS处理对M3农艺性状的影响

从表3可以看出,EMS处理对不同胡麻品种M3农艺性状的影响存在差异。‘轮选3号’处理B4C2和B4C3,‘张亚2 号’处理B2C1 和B1C3,‘C9625’处理B3C1、B4C1、B2C2 株高低于对照外,其余处理均比对照高;‘CDC SoRel’和‘内亚6号’各处理均高于对照。‘轮选3号’‘张亚2号’和‘内亚6号’各处理工艺长度均比对照高,‘CDC SoRel’各处理均比对照高。‘CDC SoRel’各处理分茎数均比对照高,‘内亚6号’处理B1C2比对照低,其余处理均比对照高,‘C9625’‘轮选3号’和‘张亚2 号’各处理分茎数比对照有高有低。‘CDC So Rel’和‘内亚6号’各处理分枝数均比对照高,‘张亚2号’处理B1C2高于对照外,其余处理均比对照低;‘轮选3号’处理B4C3和B3C3,‘C9625’处理B1C5低于对照外,其余处理均比对照高。‘CDC So Rel’和‘内亚6号’各处理单株果数均比对照高,‘张亚2号’处理B2C1高于对照外,其余处理均比对照低;‘轮选3号’和‘C9625’各处理比对照有高有低。‘张亚2号’各处理比对照降低了千粒质量,‘C9625’各处理均比对照高,而其他品种各处理比对照有高有低。‘CDC SoRel’和‘内亚6号’各处理比对照提高了单株产量,‘张亚2 号’各处理比对照降低了单株产量,‘轮选3号’和‘C9625’各处理比对照有高有低。

表3 EMS处理不同基因型胡麻品种M3代农艺性状Table 3 Agronomic traits of M3 generation in different flax under EMS treatment

2.4 EMS处理对M3品质性状的影响

不同处理对不同胡麻品种品质性状的影响见表4。‘轮选3 号’粗脂肪含量只有B1C1、B1C2处理高于对照,其余均低于对照;而木酚素含量各处理均高于对照,亚麻酸含量在处理B1C1 和B3C3高于对照,其余处理均低于对照;处理B1C1比对照降低了油酸含量和棕榈酸含量,其余各处理均比对照高;各处理均比对照降低了硬脂酸含量。‘CDC SoRel’在处理B1C1、B1C2、B1C3 比对照提高了粗脂肪含量,在处理B1C3、B3C1比对照降低了木酚素含量,在处理B1C1、B1C2比对照提高了亚麻酸含量;在处理B2C2比对照降低了亚油酸含量,其余处理提高了亚油酸含量。‘张亚2号’在处理B1C1、B2C1比对照提高了粗脂肪含量,在处理B1C1比对照降低了木酚素含量,在处理B1C1和B2C1提高了亚麻酸含量;比对照降低了亚油酸含量,提高了硬脂酸含量。‘C9625’在处理B2C2、B3C1比对照提高了粗脂肪含量,在处理B1C3、B1C5、B2C1比对照提高了木酚素含量,在处理B1C5、B2C2、B3C1均比对照提高了亚麻酸含量。‘内亚6号’各处理比对照降低了粗脂肪和亚麻酸含量,提高了硬脂酸含量和油酸含量;在处理B4C1比对照提高了亚油酸含量,其余处理降低了亚油酸含量,提高了棕榈酸含量;在处理B1C2比对照降低了木酚素含量,其余处理提高了木酚素含量。

表4 EMS处理下不同基因型胡麻品种M3代品质性状Table 4 Quality traits of M3 generation in different flax varieties under EMS treatment

2.5 不同胡麻品种M3代品质优异突变材料的筛选

对M3代各处理突变材料品质变异情况进行分析,统计粗脂肪、木酚素和亚麻酸含量分别≥42%、≥10 mg/g和≥60%的材料数(表5)。其中‘内亚6号’粗脂肪含量≥40%的材料有24份,没有高于42%的材料;分别从‘轮选3号’‘CDC So Rel’‘C9625’选择到亚麻酸含量高于55%的材料39份、40份和5份,但没有高于60%的材料。从1 375份M3材料中选择出高粗脂肪含量材料155份、高木酚素含量材料45份、高亚麻酸含量的材料26份,分别占总数的11.27%、3.27%和1.89%。其中从‘轮选3号’中选择到高粗脂肪含量的材料比较多,从‘张亚2号’和‘内亚6号’选择出亚麻酸含量高的材料比较多。

表5 不同胡麻品种M3代品质优异突变材料的筛选Table 5 Selection of superior mutants of M3 generation in different flax varieties

2.6 不同基因型胡麻品种最佳EMS诱变条件筛选

以EMS处理时间X1和浓度X2为自变量,田间相对出苗率为因变量Y,利用线性回归方程计算最佳EMS诱变条件。由于EMS 处理对不同粒色胡麻品种在发芽率和相对出苗率上存在显著差异,因此根据籽粒颜色通过不同线性回归方程计算最佳EMS 诱变条件。褐色籽粒Y1=1.254 5—0.055 7X1—0.537 1X2;浅黄色籽粒Y2=0.678 3—0.042 3X1—0.342 8X2,得到褐色籽粒胡麻品种的最佳诱变条件(0.6%,4 h),浅黄色籽粒品种为(0.3%,4 h)。为了获得更有利的变异条件,通过统计不同处理品质高于对照的株树,发现较低浓度和处理时间可以提高胡麻粗脂肪和亚麻酸含量,‘轮选3 号’‘CDC SoRel’在处理条件(0.6%,2 h)获得有利变异更多,‘C9625’在(0.6%,4 h)时获得有利变异多,与回归方程结果一致;在诱变条件(0.6%,4 h)时田间相对出苗率更接近50%,综合品质变异统计结果,最终得到褐色籽粒胡麻品种的最佳诱变条件(0.6%,4 h或2 h)。浅黄色籽粒品种回归方程结果与变异统计结果一致,最佳诱变条件为(0.3%,4 h)。

3 讨论

本研究表明,不同EMS 处理对种子萌发以及幼苗生长有显著的抑制作用,EMS 浓度越高处理时间越长,抑制作用就越显著,发芽率和相对出苗就越低,与已有研究结果一致[10-12]。许燕等[13]研究表明。随着EMS 浓度的增大,M1 种子存活率下降,与本研究结果一致。本研究表明,不同品种对不同EMS诱变处理反应敏感度不同,尤其不同籽粒颜色的品种间,分析原因可能与不同籽粒颜色胡麻品种特性有关,种子萌发时胚发育能力有差异;也可能与不同颜色种皮厚度或色素层不一致导致药物渗透性有差异,还需实验进一步验证。方差分析表明,不同品种、浓度和时间存在交互作用,对相对出苗率影响最大的因素是品种和处理浓度,与杨秀丽等[14]利用EMS诱变不同基因型花生品种的结果一致。

本研究通过EMS处理提高了M3代材料的株高、工艺长度、分枝数、单株果数和单株产量,千粒质量影响不明显,但不同品种和处理间也存在差异。这些变异有正向的,也有负向的,从中可能筛选出对育种有用的突变体,对今后胡麻高产育种具有积极意义。在油菜上,杨建胜等[15]研究表明,M1农艺性状除分枝数增加外,株高、主花序有效角果数、全株有效角果数、角果长度、角果粒数、千粒质量等均显著降低,与本研究结果不一致,可能与不同作物的诱变效应不确定性有关;黎诗艳等[16]研究表明,EMS 对苦荞株高以及产量方面影响显著,随着处理浓度的增加,各个指标呈递减趋势。本研究EMS 对产量性状的影响结果,还需连续多代测定验证。王允等[17]通过研究花生EMS诱变M2种子的品质性状,发现诱变可以改变花生的品质,发现了粗脂肪含量高于对照的突变体。许燕等[13]EMS 诱变花生‘珍珠红1号’筛选获得9个优良M5突变系,其中有4个表现出产量高、品质优异、综合性状优良等特点。本研究对M3种子的品质性状进行分析,发现EMS诱变可以改变胡麻的品质,不同品种间、不同处理间品质性状变异存在差异,诱变效应有正有负。从‘轮选3号’‘CDC SoRel’‘张亚2 号’可以看出,较低浓度和处理时间可以提高胡麻粗脂肪和亚麻酸含量,与陈碧云等[6]在油菜上研究结果一致。

从1 375份M3代材料中选择出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亚麻酸含量的材料26份,说明通过EMS诱变产生新的优异突变种质是可行的。这些丰富的变异类型,为胡麻进一步的遗传改良提供了新的基因资源。魏中艳等[18]通过测定EMS诱变‘中品661’M2～M7籽粒的蛋白质含量表明,高蛋白含量突变体在连续选择过程中,蛋白含量呈下降趋势;可能与高蛋白含量个体多为杂合状态,需要选择纯合高蛋白含量个体,才能创制出稳定的高蛋白种质。因此,在胡麻高代材料选择纯合单株测定品质,有利于选择出性状稳定、品质好的材料。袁润勤等[19]利用SSR 和SRAP标记检测‘中双9号’M3株系,结果表明138个株系没有完全按表型突变聚在一起,但产生了可在分子水平上检测的突变,而且诱变后代材料之间存在广泛的遗传差异。本试验主要调查了诱变后代的农艺性状变化及M3种子的品质变化情况,并未对这些突变体产生的机理及其遗传物质的改变进行研究,需进一步从分子水平上检测突变体遗传物质的变化情况,将有利于深入认识EMS 对胡麻的诱变效应,为新品种选育奠定基础。

4 结论

通过EMS 诱变不同基因型胡麻品种,发现不同胡麻品种间,尤其在不同籽粒颜色的胡麻品种间,发芽率和田间相对出苗率存在显著差异。通过不同基因型胡麻品种、EMS处理时间和浓度3因素分析,对胡麻相对出苗率影响最大的因素是品种,其次是处理浓度和处理时间。最终得到褐色胡麻品种的最佳诱变条件(0.6%,4 h 或2 h),浅黄色籽粒品种最佳诱变条件(0.3%,4 h)。从1 375份M3代材料中选择出高粗脂肪材料155份、高木酚素含量材料45份、高亚麻酸含量的材料26份。