抑制剂和激活剂对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响

董艳璐,张战利,吴江波,陈 玮,袁向群,李怡萍

(1.西北农林科技大学 植物保护学院,农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室,陕西 杨凌712100;2.陕西省植物保护工作总站,西安 710003;3.宜川县农业技术推广服务中心,陕西 宜川716200)

梨星毛虫Illiberis pruni属鳞翅目,斑蛾科,又名梨叶斑蛾、饺子虫、囊粘虫等。梨星毛虫在中国广泛分布,各果品产区发生普遍,常见的危害严重地区有陕西、山东、河北等地。除危害梨树外,苹果、桃、李、杏等果树也是其主要寄主[1]。该虫是典型的食叶害虫,以幼虫成群取食果树叶片,也可钻蛀果树的嫩芽、花蕾、果实危害。为害叶片时,其吐丝将虫体包裹进叶片内,形似饺子,被取食叶片变黄、焦枯,发生严重时会导致园中果树叶片大面积脱落,从而使果树光合作用减弱,降低果树的树势,影响果树产量[2-3]。

在昆虫中,营养物质的消化吸收主要在中肠进行,中肠有多种消化酶,包括丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶[4-5]等,其中,丝氨酸蛋白酶家族是大多数昆虫消化作用的关键参与者,属重要的蛋白水解酶[6-7]。对鳞翅目害虫中肠蛋白酶的研究主要集中在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶上,二者是最重要的丝氨酸蛋白酶[8]。蛋白酶抑制剂在一些动物、植物和微生物中参与昆虫的相互作用,常用于研究昆虫蛋白酶活性。抑制作用取决于抑制剂的类型、浓度、抑制剂与酶的比例等[9]。植物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂在抑制昆虫蛋白酶方面起主要作用,并已用于防治害虫[10]。Broadway等[11]发现马铃薯蛋白酶抑制剂Pl-2(马铃薯抑制剂Ⅱ)在低浓度时可抑制甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫肠道中的大部分胰蛋白酶活性。Mcmanus等[12]发现50 mg/L的STI对斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫胰蛋白酶活性的抑制率高达88%。然而,迄今为止,关于梨星毛虫中肠蛋白酶的研究鲜有报道。

目前对于梨星毛虫的防治主要是化学防治,化学农药的使用带来了“3R”等问题,因此,寻找一种新的绿色防控技术迫在眉睫。本研究测定梨星毛虫幼虫不同龄期中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性,在最适龄期(4龄)下,测定不同激活剂和抑制剂对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响。研究结果为以昆虫中肠蛋白酶为靶标的新型农药的研发和转基因抗虫作物的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

梨星毛虫幼虫预试验由张战利和吴江波提供,正式试验幼虫采自西北农林科技大学南校区海棠树。采集的幼虫直接用于试验测定,以30只幼虫为样品,每个样品重复3次。

1.2 主要试剂

牛血清白蛋白(BSA)由美国Equitech-Bio公司提供。甲基磺酰-L-苯丙氨酸氯甲酮(Tosylphenylalanine chloromethyl-ketone,TPCK)、氨苯磺胺偶氮酪蛋白(Azocasein)、Nα-p-甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯(Tert-amyl methyl ether,TAME)、大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibitor,STI)、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester,BTEE)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、Na-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺(Na-benzoyl-DLarginine pnitroanilide,BAPNA)、甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲酮(N-tosyl-L-lysyl chloromethyl-ketone,TLCK)均由美国Sigma Aldrich公司提供。乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、乙二醇二乙醚二氨四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid,EGTA]由美国英杰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 中肠酶液的制备 取2～5龄梨星毛虫幼虫,用预冷的0.15 mol/L NaCl溶液冲洗虫体,并在冰上快速解剖,收集其中肠。将收集样品用生物组织研磨机在4 ℃匀浆,随后在4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min,收集上清液作为中肠蛋白酶粗提物。

1.3.2 中肠酶液蛋白浓度的测定 参照Bradford[13]方法,选取BSA(牛血清白蛋白)作为标准蛋白,使用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒测定提取物中蛋白质的浓度。利用酶标仪测得吸光度,为保证样品的吸光度值在特定范围内(标准曲线的1/2～2/3),将提取的中肠酶液稀释至相同浓度,随后检测蛋白酶活性。

1.3.3 不同龄期幼虫中肠蛋白酶活性的测定参照赵爱平等[14]的方法进行测定,每个处理设定3组重复。

总蛋白酶活性测定:以20 mg/m L 的偶氮酪蛋白作为反应底物,用0.15 mol/L 的NaCl溶液进行配制。先后分别在1.5 m L的离心管中加入10μL的中肠酶液、90μL的0.1 mol/L反应缓冲液Tris-HCl和100μL的偶氮酪蛋白溶液。随后将混合液置于37 ℃恒温水浴中孵育2 h,而后加入150μL预冷的20%(质量与体积比)三氯乙酸终止酶促反应。将最终反应液在4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min。收集上清液200μL并加入到96孔板中,立即使用酶标仪在415 nm处测量吸光度。

强碱性胰蛋白酶活性测定:以20 mg/m L 的BAPNA 作为反应底物,用二甲基亚砜进行底物溶液的配制。向96孔板中先分别加入90μL 0.1 mol/L KH2PO4/NaOH 缓冲液,再各加入10μL中肠酶液,最后加入100μL 20 mg/m L BAPNA底物。37 ℃下反应20 min,在405 nm 处测定吸光值。

弱碱性胰蛋白酶活性测定:以2 mmol/L 的TAME 作为反应底物,用0.15 mol/L的NaCl溶液进行配制。反应体系同上,使用酶标仪在247 nm 处测定吸光值。

胰凝乳蛋白酶活性测定:以1 mmol/L 的BTEE 作为反应底物,用10%(体积比)的甲醇0.15 mol/L NaCl溶液配制。反应过程同上,在256 nm 处测定吸光值。

1.3.4 抑制剂及激活剂对中肠蛋白酶活性的影响 激活剂种类及浓度分别为:5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L CaCl2、5 mmol/L EDTA、10 mmol/L EDTA、5 mmol/L EGTA、10 mmol/L EGTA。抑制剂种类及浓度分别为5 mmol/L DTT、10 mmol/L DTT、5 mmol/L PMSF、10 mmol/L PMSF、2 mmol/L TPCK、4 mmol/L TPCK、1 mmol/L TLCK、2 mmol/L TLCK、5 μg/m L STI、10μg/m L STI、5 mmol/L IAA、10 mmol/L IAA。dd H2O 作为对照,每组处理重复3次。总反应体系包括100μL 反应底物、10μL 抑制剂、10μL 中肠酶溶液、80μL 反应缓冲液,随后在30°C孵育15 min,用酶标仪在不同波长下测定吸光值。其中,特异性底物、缓冲液和波长均参照“1.3.3”中的方法。

1.3.5 数据分析 基于方差的正态性和同质性假设,对对照组和处理组之间的统计差异进行方差分析,然后用LSD 和Tukey’s检验其5%的显著性。对所有试验数据均采用SPSS Statistics 26.0和Origin 8.5进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同龄期梨星毛虫幼虫中肠蛋白酶活性

4种中肠蛋白酶活性在梨星毛虫幼虫不同龄期间差异显著,且均在4 龄具有最高酶活性(图1)。由图1-A 可知,梨星毛虫幼虫中肠总蛋白酶在4龄具有最高活性,其次是5龄,且2龄幼虫总蛋白酶活性显著低于4龄。强碱性胰蛋白酶在梨星毛虫幼虫不同龄期间,其活性整体呈先上升后降低的趋势,在4龄时具有最高值,且显著高于2龄酶活性(图1-B)。弱碱性胰蛋白酶也在4龄具有最高酶活性,其次是3龄,2龄酶活性最低(图1-C)。胰凝乳蛋白酶活性整体高于其余3种蛋白酶,在2.1～2.4 OD/(min·mg)范围内波动,变化趋势和弱碱性胰蛋白酶相同,酶活性在4龄最大(图1-D)。可见,梨星毛虫4龄幼虫中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有最高活性,2龄幼虫的活性最低。

2.2 不同激活剂和抑制剂对中肠蛋白酶活性的影响

测定蛋白酶抑制剂和激活剂对梨星毛虫4龄幼虫中肠蛋白酶活性的影响,结果表明:总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性差异较大,且激活剂一般对蛋白酶产生促进作用,而抑制剂则对蛋白酶产生抑制作用,但当浓度发生变化或作用对象不同时,激活剂可能起到抑制作用,抑制剂也可能起到激活作用。

与对照组相比,各处理组对总蛋白酶活性均起到激活作用(图2-A)。激活作用较好的处理组分别是10 mmol/L EGTA、2 mmol/L TPCK、5 mmol/L DTT。且除处理组DTT 与TPCK 外,其他试剂均为高浓度的激活作用大于低浓度,其中EGTA 处理组中,不同浓度的激活效果差异最大。

强碱性胰蛋白酶测定结果表明,对其产生抑制作用的试剂由强到弱依次为5 mmol/L CaCl2、5 mmol/L EGTA、10 mmol/L PMSF、5 mmol/L PMSF、10 mmol/L EGTA(图2-B)。其余试剂均对强碱性胰蛋白酶产生激活作用,激活作用最强的为5 mmol/L DTT 和10 mmol/L DTT。研究中还发现,CaCl2在高浓度时表现激活作用,低浓度时则表现抑制作用,与之相反的是IAA,在低浓度表现激活作用,在高浓度则与对照组差异不大。

除5 mmol/L DTT 外,其余所有试剂均对弱碱性胰蛋白酶产生激活作用(图2-C)。激活作用较好的依次为4 mmol/L TPCK、2 mmol/L TLCK、1 mmol/L TLCK、10 mmol/L IAA、2 mmol/L TPCK。5 mmol/L EGTA、5 mmol/L DTT 和5 mmol/L PMSF 处理组与对照组激活作用差异不显著。其次,除EGTA 的两个处理组外,其余处理组都随着浓度的增大,弱碱性胰蛋白酶活性增大,即浓度越大激活作用越强。

对于胰凝乳蛋白酶活性的测定发现,仅EGTA 与DTT 的两个处理组对胰凝乳蛋白酶具有抑制作用,其中高浓度的10 mmol/L EGTA 抑制效果最显著,DTT 则是低浓度处理组的抑制效果较好(图2-D)。激活作用效果较好的依次为,4 mmol/L TPCK、2 mmol/L TPCK、2 mmol/L TLCK、10 mmol/L IAA、10 mmol/L CaCl2。其中TPCK 处理组具有较高的激活作用。

经过筛选发现,所有试剂对总蛋白酶均表现激活作用,CaCl2、PMSF、EGTA 对强碱性胰蛋白酶均有抑制作用,其中效果最佳的为5 mmol/L CaCl2,在弱碱性胰蛋白酶活性研究中发现,仅有5 mmol/L DTT 具有抑制作用,EGTA 和DTT对胰凝乳蛋白酶均有抑制效果,抑制活性最高的为10 mmol/L EGTA。

3 讨论

由于昆虫在不同发育阶段的生理代谢具有差异性,进而表现为中肠蛋白酶活性也具有一定差异[15]。樊艳平等[16]测定了不同龄期的绿豆象Callosobruchus chinensis幼虫中肠各种蛋白酶的活性,发现随龄期的升高,酶活性越大。曾纪岚等[17]的研究表明:4种中肠蛋白酶(总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)活性随甜菜夜蛾幼虫龄期的升高而降低,这与樊艳平等[16]的报道不同。本研究结果表明,梨星毛虫幼虫在4龄时中肠蛋白酶活性最高,2龄最低,与曾纪岚等[17]的研究结果一致。梨星毛虫幼虫在4龄生长发育较为旺盛,具有较强的取食能力,进而消化酶活性较高,因此4龄中肠蛋白酶活性均高于其他龄期。5龄幼虫准备进入化蛹阶段,取食量有所下降,导致其生理代谢活动减弱,中肠蛋白酶活性降低。以上结果说明梨星毛虫幼虫中肠蛋白酶活性的变化与其生长发育密切相关。

不同蛋白酶抑制剂对昆虫中肠蛋白酶抑制作用差异显著。有研究表明[18],不同抑制剂对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis幼虫蛋白酶活性的抑制作用不同,PMSF、TLCK、E-64、Pepstatin A、Leupeptin抑制总蛋白酶活性;PMSF 显著降低胰凝乳蛋白酶活性;EDTA、PMSF、TPCK、TLCK、E-64显著降低胰蛋白酶活性。在研究不同蛋白酶抑制剂对小菜蛾Plutella x ylostella中肠蛋白酶活性影响时发现[19],CaCl2、EDTA 和EGTA 仅抑制胰蛋白酶;PMSF、TLCK、TPCK、STI和PMSF 抑制总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;TLCK 抑制总蛋白酶和强碱性胰蛋白酶,而TPCK 只激活强碱性胰蛋白酶的活性;STI对所有的蛋白酶都有抑制作用。本研究中大部分试剂对梨星毛虫4龄幼虫中肠蛋白酶起激活作用,仅少部分试剂具有抑制作用。所有试剂对总蛋白酶均表现为激活作用,对强碱性胰蛋白酶抑制作用最高的为5 mmol/L CaCl2,仅有5 mmol/L DTT 对弱碱性胰蛋白酶有抑制作用,对胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的为10 mmol/L EGTA。本研究与前人结果差异原因可能是梨星毛虫的中肠蛋白酶对抑制剂具有选择性,即某种抑制剂对其他昆虫具有抑制作用,但对梨星毛虫却具有激活作用。另外,也可能与昆虫对抑制剂的敏感程度有关。有研究者[20-21]发现,只有斜纹夜蛾的1龄幼虫在饲喂含有大豆胰蛋白酶抑制剂的饲料时生长速度降低,但整体发育仅延迟大约1 d,同样,在对马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata的研究中也发现,仅有1龄、2龄幼虫对水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂敏感。

同种抑制剂在不同浓度抑制作用差异较大。对美洲条螟Diatraea saccharalis的研究表明,随着抑制剂Ap TI浓度的增加,胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性均呈下降趋势[22]。本研究发现,在总蛋白酶中,除处理组DTT 与TPCK 外,其他试剂均为高浓度的激活作用大于低浓度;在强碱性胰蛋白酶中,CaCl2在高浓度时表现激活作用,低浓度时则表现抑制作用,与之相反的是试剂IAA 在低浓度表现激活作用,在高浓度则与对照组差异不大。其差异原因可能在于不同昆虫间具有物种差异性,且不同抑制剂处理组的抑制活性本身差异较大,不同浓度作用于昆虫中肠蛋白酶时就会产生不同的作用效果。本研究结果显示:低浓度的CaCl2对强碱性胰蛋白酶有较强的抑制作用,高浓度CaCl2则起激活作用。可能与不同浓度下钙离子与目标蛋白酶活性位点的结合情况不同有关。

由于昆虫在进化过程中形成了不同的取食习性,因此,发挥主要功能的中肠蛋白酶也具有差异。例如,鞘翅目和半翅目倾向于利用半胱氨酸蛋白酶,而膜翅目、双翅目、鳞翅目和直翅目倾向于利用丝氨酸蛋白酶[23]。本研究结果表明,强碱性胰蛋白酶的活性在梨星毛虫幼虫各龄期整体偏高,说明梨星毛虫主要倾向于利用强碱性胰蛋白酶进行消化吸收。

4 结论

本研究测定出梨星毛虫幼虫4龄的中肠蛋白酶具有最高酶活性,在此龄期进行抑制剂筛选发现,不同浓度及种类试剂对4种中肠蛋白酶活性影响差异显著,所有试剂对总蛋白酶均表现为激活作用,5 mmol/L CaCl2对强碱性胰蛋白酶抑制作用最高,仅5 mmol/L DTT 对弱碱性胰蛋白酶有抑制作用,对胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的为10 mmol/L EGTA。本试验为后续抑制剂对梨星毛虫的体内活性作用的研究提供了参考依据,便于明确抑制剂对梨星毛虫生长发育的影响,为以中肠蛋白酶为靶标,研发含抑制剂的生物源药剂或转基因作物的绿色防控提供参考。