实验动物质控能力验证中酯酶-1和转铁蛋白检测能力评价*

王 洪 魏 杰 光姣娜 周佳琪 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

能力验证的定义是利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[1]。能力验证是实验室外部质量控制的重要组成部分。能力验证计划的组织实施有助于了解实验室能力，识别实验室间的差异，提高实验室技术水平，为服务客户提升信心。同时有助于识别实验室管理体系和技术能力可能存在的问题和风险。能力验证是实验室能力评价的重要手段。实验室参加能力验证活动一次满意或不满意，存在一定偶然性，但某个项目多次不满意或一个单位参加多个项目同时不满意，则表明其技术能力存在问题，质量管理体系存在风险。本实验室自2013年起，连续8年组织实施符合国际质量管理体系认可的实验动物质量控制领域相关的能力验证计划。

实验动物在生物制品质量控制领域和药物安全性评价领域应用广泛，实验动物与实验试剂、实验仪器一样直接影响科学研究的实验结果。实验动物质量的标准化直接决定生物医药研究产出实验数据的准确性和可重复性。实验动物的质量控制归根究底是对动物实验产出数据的质量控制。实验动物的标准化包括遗传质量控制和微生物质量控制，而实验动物的遗传质量是所有动物实验开展的前提和基础，遗传质量不合格的实验动物必然无法保证实验数据的准确性和可重复性。本次能力验证计划中的检测项目酯酶-1和转铁蛋白属于实验动物遗传质量控制领域的检测项目，该能力验证计划主要用于考察实验室在实验动物遗传质量控制方面的检测水平。

本次能力验证NIFDC-PT-202计划的组织实施旨在考察实验室在酯酶-1和转铁蛋白这两个项目的检测能力，帮助实验动物质量控制实验室发现问题，同时促进我国实验动物质量控制水平的提升。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：8周龄，雌性，近交系小鼠CBA,20只；8周龄，雌性，近交系小鼠 C57BL/6 20只，均来源于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证编号SCXK(京)2014-0004，实验动物使用许可证编号SYXK(京)2017-0013。动物福利伦理审批号【中检动(福)第2019(A)001号】。按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.1.2仪器设备：离心机【品牌：Thermo，型号：X1R，购自赛默飞十世尔科技(中国)有限公司】；真空冷冻干燥机(品牌：LABCONCO，型号：FREEZONE4.5，LABCONCO公司)。

1.2 方法

1.2.1检测样品：本次能力验证计划提供的被测样品为实验小鼠血清冻干粉。制备方法按照国家标准GB/T14927.1—2008 准备抗凝真空采血管BD vacutainer，K2 EDTA抗凝，采集血液样本，离心3 000 r/min 10 min，分离血浆。加入保护剂，分装，每瓶装量为50 μL血浆，用冻干机冻干，加盖。实验小鼠血浆冻干粉为淡粉色固体。对样品进行随机编号，-30 ℃保存备用。每个参加单位将获得样品5份，通过泡沫箱加干冰和冰袋的方式运输。样本经过均匀性和稳定性检验，满足质量控制的要求[2]。

1.2.2参加单位：本次能力验证计划面向全国实验动物质量检验机构，全国药品质量检定系统，以及相关企业高校研究所的实验室。报名参加本次能力验证计划NIFDC-PT-202的单位共计9家，所有实验室全部提交了检测结果。9家实验室包括7家省级实验动物质检机构和2家研究所实验室。

1.2.3能力验证项目：本次计划要求进行实验小鼠血清中酯酶-1和转铁蛋白检测，检测指标包括酯酶-1 a基因型、酯酶-1 b基因型、转铁蛋白a基因型和转铁蛋白b 基因型。

1.2.4实验方法：本次能力验证计划推荐依据国家标准GB/T14927.1—2008进行检测。为保证检测结果具有可比性，能力验证样品无需加工处理，加入50 μL蒸馏水溶解后即可进行检测。检测结果为定性的结果，报告基因型a型或b型。检测结果填写在能力验证网络平台。纸质版原始记录通过邮寄发送到能力验证计划组织方。

1.2.5评价方法：本次能力验证计划的结果是定性结果，将各实验室上报的检测结果与标准结果进行比较，实验室提供的结果与标准结果一致时，判定为满意；实验室提供的结果与标准结果不一致时，判定为不满意；如果实验室未按作业指导书要求的时限提交检测结果，判定为不满意。

2 结果

收集整理参加实验室反馈的原始记录，本次能力验证计划的参加实验室均采用国家标准GB/T 14927.1—2008中推荐的生化标记检测法。本次计划共发出样本9份，每份5支，9家实验室全部提交检测结果。获满意结果的实验室有7家，2家实验室获得不满意结果(实验室代码138和287)。该计划的满意率为77.78%。

2.1 样品检测前运输和存放

实验室收到样本的快递时间1～3 d，收到样品后实验室存放样品至检测的时间1～11 d。详见表1。

表1 各实验室样品快递时间和样品检测前的保存时间明细表Table 1 Sample delivery time and storage time before testing in each laboratory

2.2 实验室醋酸纤维素膜的选择

实验室分别选择国产软膜(1家，实验室代码092)、国产硬膜(7家)和进口硬膜(1家，实验室代码181)进行检测(图1～3)。

图1 国产软膜( 092实验室)Fig.1 Domestic soft membrane (092 laboratory)

图2 国产硬膜Fig.2 Domestic hard membrane

图3 进口硬膜(181实验室)Fig.3 Import hard membrane (181 laboratory)

2.3 检测方法及检测点样位置

在转铁蛋白这个检测项目上，有1家实验室(实验室代码181)选择非标方法-氨基黑染色法进行检测。其他8家实验室均选择国家标准中推荐的丽春红染色法(图4～5)。

图4 国家标准方法(丽春红法)Fig.4 National standard (Method Ponceau)

图5 非国家标准方法(氨基黑方法，181实验室)Fig.5 Non-standard method (amino black, 181 laboratory)

实验室(实验室代码118和092)变换点样的位置，重复多次进行检测，保证检测结果的准确性(图6～7)。

图6 778实验室Fig.6 778 laboratory

图7 092实验室Fig.7 092 laboratory

2.4 电泳的边缘效应

由于电泳的边缘效应导致边缘加样孔样本的泳动距离发生偏离(图8)。

琢句之法，唯少陵独尽其妙。……及至苏、黄，则使事亦精，逸气横出，琢句之妙可以与少陵并驾。……诗家作诗多使事，谓之点鬼簿。……近者苏、黄崛起，虽追尚其法，而造语益工，了无斧凿之痕，可谓青于蓝矣。……山谷云“语言少味无阿堵，水雪相看只此君”，“眼看人情如格五，心知世事等朝三”，类多如此。[10](8册，P11-36)

图8 边缘效应(138实验室)Fig.8 Edge effect (138 Laboratory)

3 讨论

3.1 影响本次能力验证结果的关键因素

建议实验室着重从以下5个方面分析能力验证结果，有助于实验室找到不满意结果的原因。

3.1.1样品的保存条件：样品的稳定性研究表明，本次能力验证计划的样本应保存于-20 ℃，而且不宜长期保存。实验室应根据自身条件及时安排实验。应保证样品的保存条件不影响样品的稳定性，以保证检测结果的稳定和能力验证结果的准确。

3.1.2醋酸纤维素膜的选择：9家参加本次能力验证的实验室使用了3种规格的醋酸纤维素膜：进口硬膜60 mm×76 mm，国产硬膜70 mm×90 mm，国产软膜70 mm×90 mm。3种膜规格不同，涂层厚度不同，涂层的颗粒大小不同，电泳条带形状不同，电泳条带清晰度不同。实验室需考虑到不同规格的醋酸纤维素膜对实验结果的影响。

3.1.3染色方法的选择：国家标准染色方法：0.5% Ponceau S 溶解于 5% 三氯乙酸，1%冰醋酸。非标染色方法：氨基黑0.01 g，甲醇40 mL，冰醋酸10 mL，蒸馏水50 mL。脱色：甲醇40 mL，冰醋酸10 mL，蒸馏水50 mL。非标方法的条带颜色与背景色差明显，结果易于读取。

3.1.4重复性验证的重要性：能力验证样品的构成通常模拟实际工作中的复杂情况，配置多种类型的样本。实验室有必要进行重复，保证检测结果的准确性。而且建议调整样本的点样顺序，避免不同位置导致的偏差，保证能力验证结果的可靠性。

3.1.5点样位置对检测结果的影响：理想的平板电容器的电场线是直线的，但在实际情况下，靠近边缘的地方电场线会变弯，越靠近边缘就弯的越严重(电泳的边缘效应)。因此，造成靠近边缘加样孔的检测结果出现偏差。避免边缘效应的方法，其一，在有剩余加样孔的情况下，重复点样；其二，变换点样位置，多张醋酸纤维素膜进行检测。

3.2 能力验证计划实施流程[3-19]

方案设计：本次能力验证计划的位点选择实验小鼠遗传质量检测生化标记检测法中血清样本的全部两个位点酯酶-1和转铁蛋白，每个实验室发放样本数量为5支，为历年来样本数最多的一次。同一个计划考察两个项目，每个实验室收到5个样本，都增加了本次能力验证活动的难度。

均匀性检验和稳定性检验：本次能力验证计划的样本通过均匀性检验后进行保藏稳定性(短期稳定性和长期稳定性)、运输稳定性和最终的稳定性验证。

能力验证计划的实施还包括发放样品，反馈结果和汇总报告。

3.3 能力验证结果的利用和纠正措施的选择[20-21]

对于参加能力验证计划，获得不满意结果的实验室，实验室应核查实验室的人员、仪器设备、试剂、操作方法，依据标准、环境因素等方面，找到不满意结果的原因。实验室可以在180 d内参加该项目的测量审核活动，对不满意结果进行纠正。测量审核是“一对一的能力验证”。

只有在能力验证活动中表现满意，或对于不满意结果能证明已开展了有效纠正措施的实验室，CNAS方受理认可申请或予以认可。对参加能力验证活动，且有稳定满意表现的实验室，在CNAS的各类评审中可考虑适当简化相关项目的能力确认过程。实验室应保存上述记录以备评审组检查。当不满意结果已不能符合专业标准或规范时，除实施纠正措施并验证其有效性外，实验室还应自行暂停在相应项目的证书/报告中使用CNAS 认可标识。在验证纠正措施有效后，实验室可自行恢复使用认可标识。对不能满足能力验证领域和频次要求，或虽参加了能力验证但结果不满意且未在180 d内开展纠正措施及其验证活动的实验室，CNAS 可撤销其相应项目的认可资格。

通过组织实施本次能力验证计划NIFDC-PT-202 实验小鼠血清中酯酶-1和转铁蛋白检测，作者发现实验动物质量控制实验室在酯酶-1和转铁蛋白的整体检测水平较高，少数实验室存在提升空间。本研究中对实验室在酯酶-1和转铁蛋白检测能力评价的结果，能够促进我国实验动物质量检测水平的提升。