不同因素对苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1标准样品的影响分析*

魏 杰 王 洪 光姣娜 周佳琪 付 瑞 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

苹果酸脱氢酶(malic enzyme，ME)和异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydorgenase，IDH)是三羧酸循环及其补充反应中的关键酶，在生物体能量代谢、合成及抗氧化过程中发挥着重要作用[1-2]。同工酶家族中ME-1和IDH-1的研究，不仅在生物发酵、种质选育以及肿瘤诊疗中发挥着重要作用，也是实验动物遗传质量控制国家标准中近交系小鼠的重要评价项目[3-6]。

我国检测机构众多，一方面有助于加强对产品的质量控制，另一方面由于各机构检测能力参差不齐。不同机构得到检测数据的有效性和科学性也为监管和公信带来了新的问题。因此，制备标准样品对检测机构进行能力评定就显得尤为重要。

本研究制备小鼠肾匀浆来源的ME-1和IDH-1标准样品，并通过品系差异、冻融、时间温度、运输、浓度等因素对标准样品的影响进行研究，从而为近交系小鼠遗传质量控制检测能力评定提供支持。

1 材料和方法

1.1 动物来源

BALB/c和C57BL/6小鼠各10只，8周龄雄性，购自中国食品药品检定研究院，实验动物生产许可证号SCXK(京)2017-0005；CBA小鼠10只，8周龄雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。本单位实验动物使用许可证号SYXK(京)2017-0013。本实验经过中国食品药品检定研究院实验动物福利审查，伦理号：中检动(福)第2019(A)001号。

1.2 仪器

Sartorius 酸度计(赛多利斯公司)，ML4002 电子天平(梅特勒托利多公司), Bead Ruptor 24 Eilte 样品均质仪(OMNI公司), Thermo Multifuge X1R 离心机(赛默飞世尔公司), LABCONACO 冻干机(labconco公司), 海尔BCD冰箱(青岛海尔公司), Thermo恒温箱(赛默飞世尔公司), BioRad 3000Xi 电泳仪(伯乐公司)、 微量点样器(北京六一厂)。

1.3 试剂和耗材

灭菌手术器械(上海医疗器械有限公司); Bead Ruptor 匀浆管(OMNI公司)、Greiner 冻存管(格瑞纳公司)、冻存保护剂(西格玛公司);三 羟甲基氨基甲烷与甘氨酸(北京中生瑞泰公司)、ME-1 和 IDH-1 染色试剂盒(本单位自行研制)、醋纤膜(浙江路桥公司)。

1.4 标准样品的制备

将3个品系实验小鼠进行CO2安乐死，并分别取肾脏置于烧杯中称质量，按照W(肾)∶V(水)=1∶2的比例，向Bead Ruptor匀浆管中加入遇冷蒸馏水，并置于Bead Ruptor 24 Eilte样品均质仪中按照肾匀浆程序匀浆。配平匀浆产物，置于4 ℃离心机中，12 000 r/min离心30 min，分品系分离上清至冻存管，按照7∶3比例加入冻存保护剂，置于冻干机冻干后于低温冰箱冻存备用。

1.5 均匀性测定程序

先将C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠肾匀浆按品系分组。按照4%的比例随机抽取3个品系标准样品，每管加入70 μL蒸馏水，混匀后取10 μL加入微量点样器中，于Tris-Gly 8.5缓冲液浸润的醋纤膜上点样并电泳、染色，判读条带。缓冲液配置、具体实验条件及判定标准参见GB/T 14927.1—2008 ME-1和IDH-1项目[6]。

如所得条带均清晰可读，且与标准规定一致，即认为符合样品的均匀性要求。如未通过均匀性检测，则需重新制样并检测，直到符合标准规定。

1.6 时间-温度、冻融、运输及浓度对标准样品影响的测定

1.6.1冻融因素：三品系小鼠标准样品各取3管，首次测定于-20 ℃冰箱中取出加水还原测定。实验条件同均匀性测定实验。所得条带清晰可读且与标准一致，则认为一次冻融稳定性良好。初次冻融后，即将试样放入-20 ℃冰箱冷冻，每隔2 h再次取出，融化点样测定。结果判读依据与初次相同。过程中发生拖带、弥散等情况，终止冻融测定并记录测定次数。过程中一直稳定，也以3次冻融为测定终点。

1.6.2时间-温度因素：将C57BL/6、BALB/c和CBA三品系小鼠，以Cxx、Bxx和Axx进行编组。制定一个21 d观测计划，统一在各温度时间点放入待测标准样品。将时间和温度设为观测的横纵坐标，设定4 ℃，室温(RT)和37 ℃这3个温度观测点，1、2、3、7、14及21 d为观测时间，在每个坐标交点，每个型别的样品分别随机抽取两瓶进行编号，编号按照“品系-时间-温度”原则。如C57BL/6的3 d、37 ℃样品，分别标为C-3-37-1和C-3-37-2。

在取出当天进行检测。所得条带清晰可读且与标准一致，则认为该温度时间坐标点稳定性良好；所得条带中任何1条发生条带模糊不可读，则认为在该坐标点已经发生了样品的稳定性变化，记录不稳定坐标点，且不稳定点出现后的时间温度观测点随之取消。即使一直稳定，本测定的观测周期也仅为21 d时长。

汇总各型别稳定性结果，填写时间-温度稳定性表格。

1.6.3运输因素：运输条件每品系两管，干冰条件冷链，北京至沈阳、西安及成都三地往返测试。检测实验条件同均匀性测定实验。条带清晰可判读，则认为运输对稳定性无影响；否则，需要重新调整运输条件重新测试。

1.6.4浓度因素：浓度因素按照每品系一管进行原倍、1/2、1/4和1/8梯度测试。测试条件同均匀性测定实验1.5。条带清晰可判读，则认为该浓度对稳定性无影响；条带不可见，则认为该浓度对稳定性有影响。

2 结果

2.1 均匀性测定结果

C57BL/6、BALB/c和CBA三组样品按照4%的比例分别抽取8管、8管和6管。ME-1均匀性检测中C57BL/6和CBA组均为b型，BALB/c组为a型。IDH-1均匀性检测中，C57BL/6和BALB/c组均为a型，CBA组为b型，且与GB/T 14927.1—2008标准规定一致(图1)，随机抽样组内无差别。其中C57BL/6、BALB/c和CBA标准品，以下简称C5标、BA标和CB标。

图1 实验小鼠肾匀浆中ME-1和IDH-1均匀性检测结果Fig.1 Uniformity sampling results of ME-1 and IDH-1

2.2 冻融稳定性结果

经1～3次冻融检验，C57BL/6、BALB/c和CBA三组样品的IDH-1仍清晰可判读，与初次冻融一致。

ME-1第3次冻融结果较前两次结果，条带变淡但肉眼可读，综合判定为3次冻融对结果判别无影响(图2)。

图2 CBA ME-1和IDH-1的3次冻融结果Fig.2 Three-time freeze thawing stability results of ME-1 and IDH-1 in CBA

2.3 时间-温度因素对稳定性影响的测定

存放稳定性观察期最长21 d。经实验测定表明，三品系来源的标准样品在4 ℃和室温条件下，均可以稳定存放21 d。在37 ℃条件下，仅能稳定存放2 d，第3天开始降解(图3)，ME-1和IDH-1均出现拖带，带型和第2天和标准结果均有差异，已不可读。

图3 BALB/c ME-1和IDH-1 第2～3天37 ℃检测结果Fig.3 Results of the ME-1 and IDH-1 in BALB/c from the 2nd to 3rd day under 37 ℃

三品系不同个体和不同型别之间没有显著差异，时间-温度存放稳定性汇总结果见表1。

表1 实验小鼠肾匀浆中ME-1和IDH-1样品不同温度时间稳定性结果Table 1 Results of ME-1 and IDH-1 stability under different time and temperature condition

2.4 运输因素对稳定性影响的测定

经实验测定表明，三品系来源样品经在低温系统运输往返西安、成都和沈阳，均能稳定存在。图4为北京往返西安后的测定结果。

图4 北京-西安往返运输稳定性检测结果Fig.4 Transpotation stability results of ME-1 and IDH-1 from Beijing to Xi’an

2.5 不同浓度标准样品的测定结果

C57BL/6、BALB/c和CBA三种样品各抽一管，按照原倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍进行梯度稀释后，苹果酸酶-1和异柠檬酸脱氢酶-1各浓度测定结果和原倍一致，且均符合标准规定。1/8倍稀释，对样品稳定性无明显影响。图5给出了C57BL/6样品组各浓度梯度的检测结果。

图5 C57BL/6 样品ME-1和IDH-1浓度梯度结果Fig.5 Concentration gradient results of ME-1 and IDH-1 in C57BL/6 mice

3 讨论

作为标准物质/标准样品的重要属性的均匀性和稳定性受到抽样方法、测量环境、评价方法等多种因素的影响[7-9]。探讨不同因素对标准样品均匀性和稳定性的作用，以期更为合理的进行检测评价。

3.1 不同品系来源标准样品的制备

C57BL/6、BALB/c和CBA是近交系小鼠应用和检测中最为常见的品系。不同来源肾匀浆样品的带型显色浓度略有差异，C57BL/6和BALB/c来源的ME-1比CBA来源的样品显色更清晰，而在IDH-1位点上，3个来源样品无明显差异。如果仅制备用以区分两位点的标准样品，从动物福利角度，可以仅选用C57BL/6和CBA品系即可。从检测角度而言，应当熟悉常用品系的表型。

3.2 冻融、时间-温度、运输和浓度对样品稳定性的影响

本研究探讨了4种变量因素对样品稳定性的影响。北京往返沈阳、西安、成都三地约1 400、2 200和3 600 km，运输条件为干冰，往返时间为2～5 d。收取样品时，成都往返样品干冰已无剩余，但样品并表观未改变。因此说明非全程低温长途运输对两位点标准样品无明显影响。同时，3次冻融以及1/8倍稀释对标准样品在ME-1和IDH-1位点稳定性均无影响，但长时间高温状态对样品影响明显。室温和4 ℃条件下，标准样品21 d内均能稳定存在，但在37 ℃条件下仅能稳定存在2 d，耐高温能力介于酯酶-3(37 ℃、1 d)和过氧化氢酶-2(37 ℃、30 d)之间[10-11]。

3.3 标准样品制备方案的设计和改进

本研究从检测常用角度，选取3种品系来源小鼠制备了ME-1和IDH-1标准样品。在两位点上，综合表现为3种带型，进行能力验证计划样品发放时，可以随机发放2～3种样品，形成不同的组合结果。既兼顾了难度和公平，又能够更好地防止结果串通，有利于反应参与者的真实检测水平。

样品具有良好的均匀性和稳定性。除非37 ℃高温暴露2 d以上会出现不稳定结果。在室温(约25 ℃)及以下温度条件可稳定存在21 d。3次冻融且距离在3 600 km以内的干冰运输方式对1/8倍稀释样品的均匀性和稳定性均没有显著影响。下一步，将完善在-20 ℃的低温条件下，长期保存的稳定性研究，从而为标准样品研制、能力验证计划以及测量审核实施提供有力的基础数据。