经口喂养大鼠乳酸菌混合菌粉的毒性研究

房 晓 段荣帅 张晓元 张艳艳 孙晓康 陈 磊

(1.山东商业职业技术学院,济南 250103)(2.山东省药学科学院，济南 250101)

益生菌具有维持肠道菌群平衡、改善便秘、缓解腹泻、降胆固醇、增强免疫力等功效[1]。在全面大健康的时代背景之下，人们生活水平和健康意识日益增强，益生菌的保健作用越来越受到人们的重视。益生菌在功能性食品、保健食品、药品等领域都有广泛的应用前景。有些肠内益生菌可有效将体内碳水化合物发酵成为乳酸，研究者将这类细菌的总称命名为乳酸菌，其效用在市面上和研究中都被广泛认可。乳酸菌种属很多，如乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteria)，是现在市面上应用最广泛的菌种。抗生素耐药及体内微环境失衡仍是目前棘手问题，乳杆菌和双歧杆菌的益生剂也进入了专家和学者们的视线[2-3]，相关研究也正在开展。

我国内蒙古地区盛产奶制品，营养价值极高，为进一步提高奶制品食品安全和效用。自2001年以来，专家们开始将研究重点转移至奶制品成分分析中，以期得到优质益生菌株，加强和改善奶制品质量。目前已经分离出的优质菌株包括干酪乳杆菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang，L.casei Zhang)[4]、植物乳杆菌P-8(LactobacillusplantarumP-8, P-8)[5]、植物乳杆菌P9(LactobacillusplantarumP9, P9)[6]、鼠李糖乳杆菌R9639(Lactobacillusrhamnosus,R9639)[7]、乳双歧杆菌V9(BifidobacteriumlactisV9，B.lactis V9)及乳双歧杆菌XLTG11(Bifidobacteriumlactis，XLTG11)[8]等。上述菌株主要来源于传统发酵的酸马奶、自然发酵的酸牛奶、自然发酵的酸马奶、健康儿童肠道等。这些菌株对人工胃液、肠液及胆盐等均有良好耐酸性，是国内外目前用于开发的最重要的益生菌[4,9]。

近年来大量的研究表明，与单一的乳酸菌制剂相比，混合菌制剂表现出更好的免疫调节、抗感染等生物学功能[10-12]。但混合菌制剂的安全性有待于进一步考察。为了保证应用安全，本文对R9639+ L.casei Zhang +P-8+P9+ B.lactis V9+XLTG11组成的混合菌粉进行了28 d经口毒性研究，为其进一步的应用开发提供安全实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

受试物L.casei Zhang+R9639+P9+V9+P-8+XLTG11的活菌数均为2×1011个/g(金华银河生物科技有限公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)；血液分析仪试剂(Sysmex公司)；血凝仪专用试剂(美创公司)；尿液分析专用试剂(优利特公司)。

去离子水发生器(Millipore公司)；OLYMPUS光学显微镜BX50(奥林巴斯公司)；HITACHI U-2000型分光光度计(日立公司)；冷冻离心机Sigma4-16K(Sigma公司)；Cubis® II分析天平(赛多利斯公司)；ndiko自动生化分析仪(Thermo Scientific公司)；血细胞分析仪 XT-4000i (Sysmex公司)；全自动血凝仪Coatron 3000(美创公司)；尿液分析仪URIT-330(优利特公司)；ASP200S全封闭式组织脱水机和手动石蜡切片(Leica公司)。

1.2 实验动物及给药

SPF级SD大鼠80只，雌、雄各半，体质量68.4～80.1 g购自斯贝福(北京)生物技术有限公司【SCXK(京)2019-0010】。无菌手术于北京神瑞生物技术有限公司屏障环境动物设施【SYXK(京)2020-0001】进行，每笼4～5只，常规饲养。本实验由北京神瑞生物技术有限公司伦理委员会批准，动物伦理审批号：SRSWLL-2021091802动物房。

称取冷冻干燥保存的L.casei Zhang、R9639、P9、V9、P-8、XLTG11按照质量比2∶2∶1∶1∶1∶1的比例，用双蒸水溶解后备用。该配比是参考实验室前期各菌种在肠道的存活率和耐受性等确定的。SD大鼠随机分为4组，参考前期急性毒性实验剂量和人体实际摄入量[4,6,13]，分别灌胃给予双蒸水、含1.0、2.05、4.15 g/kg剂量的混合菌粉水溶液，每次灌胃容量为0.1 mL/20 g，每日1次，连续28 d。

1.3 检测指标

一般状态：实验期间每日观察大鼠活动、生长、呼吸、排便、死亡等状况；每周称量体质量和饲料。计算进食量及食物利用率，食物利用率=实验期间动物体质量增加(g)/实验期间动物总进食量(g)×100%。

眼部检查：实验前和实验结束时，对高剂量组和对照组实验动物进行眼部(角膜、球结膜、虹膜)检查。

脏器指数测定：28 d灌胃结束后禁食16 h，处死大鼠，肉眼检查大鼠体表、体腔及脏器，并分别取出心脏、胸腺、肾上腺、肝、肾、脾、睾丸，称重，计算各组大鼠的脏器指数。

血液学及血液生化指标：28 d灌胃结束、处死前取血，检测红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)及淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(NEUT)及其他镜检分类、血小板计数(PLT)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)；检测血中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(AKP)、尿素(Urea)、肌酐(Cre)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、氯、钾、钠[14]。

尿液检查：处死大鼠前，用代谢笼收集大鼠尿液，检测尿中尿蛋白、尿比重、pH、Glu和潜血。

组织病理学检查：首先对解剖后大鼠的各个脏器进行大体检查，如未见异常，对高剂量组与对照组大鼠的脑、甲状腺、心脏、胸腺、肾上腺、肝、肾、脾、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、卵巢、睾丸、膀胱等脏器做病理组织学检查。取各组织0.9%氯化钠溶液冲洗，按1∶20(W/V)固定于10%甲醛溶液中，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色法染色，显微镜下观察各组织有无病理学改变，并记录[15]。

1.4 统计学分析

数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0软件分析，采用单因素方差分析(ANOVA)检验，成对组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般体征观察

对照组及灌胃给予不同剂量混合菌粉的各组雌雄大鼠毛色、黏膜、分泌物、活动、生长发育等状况均良好，饮食、粪便及精神状态正常，未发现死亡、腹泻等异常现象。

2.2 眼部检查结果

试验开始后，分别于试验早期、中期、末期3个不同阶段，分别对实验大鼠进行眼部检查。与对照组一样，高剂量组大鼠的眼角膜、球结膜及虹膜检查等一般情况良好，均无异常症状。

2.3 体质量、进食量、食物利用率情况

给予不同剂量的混合菌粉期间，各组大鼠体质量均逐渐缓慢上升，各组间略有波动，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，不同剂量组进食量比较均无显著统计学差异(P>0.05)。各组大鼠总增重、总进食、总食物利用率情况见表1。雌、雄大鼠对照组及各剂量组总增重、总进食、总食物利用率未出现显著差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠灌胃给予不同剂量的混合菌粉28 d的体质量增长量、总摄食量、总食物利用率Table 1 Total weight changes, food intake, food utilization rates of rats in different groups treated with mixed lactobacter powder in 28 days

2.4 脏器指数测定结果

不同剂量混合菌粉对雌雄大鼠重要脏器脏体比的影响详见表2。可以看出，连续灌胃28 d后，低、中、高3个剂量组大鼠的心脏体比与空白对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。肝和肾是机体的主要代谢和排泄器官，肝脏指数和肾脏指数的变化可以反应菌粉对机体的代谢和排泄器官的影响。从表2可以看出，与对照组相比，各组大鼠的肝体比和肾体比均未发现显著差异(P>0.05)。脾脏和胸腺指数可初步反应机体的免疫功能强弱，从表2可以看出，各组大鼠的脾体比和胸腺体比与对照组相比均无显著统计学差异(P>0.05)。此外，各组大鼠的肾上腺体比与对照组相比无显著统计学差异(P>0.05)，各组雄性大鼠的睾体比与对照组相比均无显著统计学差异(P>0.05)，进一步证明了该混合菌粉的安全性。

表2 各组大鼠在灌胃给予不同剂量的混合菌粉28 d后脏体比Table 2 Organs to body weight ratios of rats in different groups treated with mixed lactobacter powder

2.5 血液学检查结果

2.5.1对大鼠血常规的影响：雌、雄大鼠血常规检测结果见表3。可以发现，各组血常规检测值均在正常参考值范围内。组内部分血常规检测值之间虽存在一定的差异，但与对照组相比，各给药组未出现显著性改变，且指标结果均在本实验室历史对照范围内，因此不认为有生物学意义。与对照组相比，各剂量组大鼠PT和APTT指标未出现显著性改变(P>0.05)，提示该混合菌粉对凝血无显著影响。可见，该混合菌粉对大鼠血常规主要指标无显著影响。

表3 不同剂量的混合菌粉对大鼠血常规指标的影响Table 3 Effects of mixed lactobacter powder on the hematology values of rats

2.5.2血生化检查结果：各剂量组雌、雄大鼠的血清生化指标均在正常范围(表4)。大鼠部分指标如TP、ALT、AST、ALP、TG与对照组相比存在一定差异(P<0.05)，指标结果均在本实验室历史对照范围内，因此不认为有生物学意义。其他各指标与对照组相比差异不显著。各剂量组之间的各指标值未发现显著性差异(P<0.05)，且没有剂量依赖性关系。这表明，该混合菌粉对大鼠血生化各指标无显著影响。

表4 不同剂量的混合菌粉对大鼠血生化指标的影响Table 4 Effects of mixed lactobacter powder on the biochemical indicators of rats n=10)

2.6 尿液检查结果

各剂量组大鼠的尿常规分析结果表明，与对照组比，各剂量组大鼠尿比重、pH值未发现显著性差异(P>0.05)。且各组大鼠尿液中均未发现尿蛋白、尿潜血现象。

2.7 病理学观察

28 d灌胃结束后，观察受试动物体表外观变化和体腔内脏器病理检查，未见发现显著改变。取对照组和高剂量组所有大鼠脑、胸腺、甲状腺、心脏、肾上腺、肝、肾、脾、胃、十二指肠、结肠、胰腺、肠系膜淋巴结、卵巢、睾丸、膀胱等进行组织病理学检查，主要脏器的HE染色结果见图1。检查发现，在对照组和高剂量组中，各有1只大鼠出现了支气管壁炎性细胞浸润、充血现象；另外，各有1只大鼠出现了黏膜淋巴细胞增生。但这些病理改变无特异性，无剂量依赖性，考虑为自发性病变。

图1 对照组和高剂量组大鼠主要脏器的HE染色结果Fig.1 Histological analysis of main organs excised from rats in the control and high dose groups (scale bar, 2 000 μm)

3 讨论

在益生菌的研究开发和市场应用中，属双歧杆菌、乳杆菌最为重要和广泛，主要由于这两种菌株有显著控制肠道感染、均衡菌群、增强肠道免疫力及抗肿瘤等多种功效。近年来大量的研究表明，与单一的乳酸菌制剂相比，混合菌制剂表现出更好的免疫调节、抗感染等生物学功能[11-12]。乳酸菌R9639、L.casei Zhang、B.lactis V9、乳杆菌P-8、P9、 XLTG11等均具有优良的益生性能，逐渐成为业界的研究热点[5-7]。研究证实，生菌在不同的生存环境下，其代谢过程及代谢产物可能完全不同[16]。因此，即便是公认的安全性良好的益生菌，安全性评价仍是其被制备为混合菌制剂后必不可少的环节[17]。

食用益生菌的安全性在世界范围内已经得到广泛重视[18-19]。如何评价益生菌的安全性要视试验的效果和菌株而异[20-21]。如采用溶血试验、抗菌药物敏感试验、斑点叉尾鮰急性毒性试验、凡纳滨对虾急性毒性试验、破损皮肤刺激性试验、急性眼刺激试验和急性腹腔注射试验等指标进行了虾源蜡样芽胞杆菌D7的毒理学评价[19]。采用雌雄小鼠急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、Ames试验和大鼠30 d喂养试验等对Mix-G200益生菌粉进行安全性试验[20]。KABEIR等[21]采用灌胃法给与小鼠不同剂量的假链状双歧杆菌菌粉进行血清酶试验、肝脏指数测定及肠道组织学染色等来评价其安全性。也有研究者通过急性毒性试验、小鼠组织学形态观察和肝脏功能定等研究益生菌的安全性[10]。

目前我国对无传统食用习惯的益生菌制剂的毒理学评价要求包括急性经口毒性试验、致病性试验、三项遗传毒性试验、28 d经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验(依国内外食用情况确定)[18]。本研究混合菌粉中的R9639、L.casei Zhang、P-8+P9+ B.lactis V9、XLTG11菌株主要来源于传统发酵的酸马奶、自然发酵的酸牛奶、自然发酵的酸马奶、健康儿童肠道等。前期的急性毒性试验及相关指标检测结果均显示L.casei Zhang及B.lactis V9冻干粉无毒副作用作用[10,22]。本文在前期急性毒性研究的基础上进行了R9639、L.casei Zhang、P-8+P9+ B.lactis V9、XLTG11混合菌粉的28天经口毒性试验，并参考实验室前期各菌种在肠道的存活率和耐受性等确定了其配比。

本文重点从给予不同剂量的菌粉后大鼠的一般状态、摄食量、食物利用率、总增重、眼部检查、脏器指数、血液学检查、尿常规及组织病理学状态等方面研究了该混合菌粉对大鼠的毒性作用。给药28 d期间，各组大鼠生长情况良好，体质量逐渐增长，但各组间未发现显著性差异。且给药期间，各给药组大鼠的行为、粪便、摄食量、总增重、总进食、总体食物利用率等均未发现显著异常(表1，P>0.05)。高剂量组和对照组大鼠试验前后眼部检查结果均无异常。各剂量组大鼠血液学指标均在正常值范围内，与对照组相比差异无统计学意义。

脏器指数测定及HE病理学染色也是评价药物对机体重要脏器影响的常用手段。脏器指数测定结果表明，与对照组相比，各给药组大鼠脏体比均未发现显著改变。HE病理学染色结果表明，高剂量组组织病理学检查结果基本在正常形态学范围内，与对照组比较，无显著性差异，这进一步证明了其安全性。

益生菌安全性评价的内容除了急性经口毒性试验、28 d经口毒性试验外，还包括致病性试验、3项遗传毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验等。本文所进行的28 d经口毒性试验初步证明了其安全性。其全面的安全性评价尚需进一步的试验来证明。