丁酸钠对细胞凋亡和实验动物影响的研究进展*

王浩然 廖 轶 姚 娇 赵德明 周向梅

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

丁酸钠(sodium butyrate；NaB)呈白色、具有腐败的臭味。与水混溶，易溶于有机溶剂，由于丁酸易挥发的性质，在动物饲料中添加丁酸钠是最经济有效的方法[1]。机体可以从肠道菌群作用下发酵膳食纤维来产生丁酸。研究发现给幼龄反刍动物饲喂丁酸钠可以很好地促进瘤胃乳头的生长，丁酸还能提供结肠上皮细胞能量，有助于组织的修复和发育[2]。

细胞凋亡是细胞程序性死亡方式之一，细胞凋亡是一种主动的死亡过程，受一系列基因激活、表达和调控的影响，细胞凋亡参与机体内细胞数量的调节，并清除体内无功能、损伤、有害的细胞，在机体的稳态和发育过程中起到重要的作用。细胞凋亡主要由三条通路引起，分别为线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路[3]。

丁酸钠处理的实验动物模型主要由炎性反应、肿瘤以及营养代谢组成。此类动物模型对不同疾病的机制研究起到了重要的作用[4]。本文梳理了丁酸钠影响细胞凋亡的具体机制，比较了丁酸钠在不同实验动物中的作用，讨论了丁酸钠在不同细胞系以及动物模型中的作用差异，旨在为阐明丁酸钠在疾病治疗中的重要作用。

1 丁酸钠对细胞凋亡的影响

丁酸钠作为一种组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂，具有调控细胞凋亡的能力。现有的研究证明，丁酸可直接作用于凋亡通路或凋亡相关蛋白起到调节作用。

1.1 丁酸钠激活死亡受体通路诱导凋亡

丁酸钠通过增加肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的表达从而介导凋亡[5]。TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)家族中的成员，TRAIL能和死亡受体(death receptor 4,5, DR4、DR5)相结合诱导包括结肠癌细胞的死亡。丁酸可增强人结肠癌细胞(HT-29和HCT-116)对TRAIL介导的细胞凋亡的灵敏度。丁酸钠激活许多的转录基因都涉及到SP1位点[6]，例如丁酸钠可以激活重组人半乳糖凝集素1基因(Galectin-1)、线粒体HMGCoA合成酶基因和p21Waf1基因启动子的Sp1位点。正常情况下HDAC会和DR5基因的转录位点SP1结合，当外源添加丁酸钠时可以阻断HADC与SP1的结合，SP1激活DR5的表达，DR5和TRAIL结合后活化caspase-8进而激活caspase-3、7诱导凋亡的产生，当然这种情况是DR5独立发生的与DR4无关[7](图1)。此外，丁酸钠处理8个结肠癌细胞系后增强了其中的7个细胞系Fas依赖的凋亡。但丁酸钠并不增加Fas受体的表达，对于TNF-α和IFN-γ联合用药介导的凋亡，丁酸钠处理后会增强这种凋亡，但并不是调控FADD/Mort1适配子的水平而是增加它的敏感性，因此丁酸钠作为一种毒性低、可以增强癌症细胞内Fas传递信号的药物，可能具有治疗意义。

1.2 丁酸钠激活线粒体通路诱导凋亡

丁酸钠可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡，这个机制可能与HDAC抑制剂会促进凋亡蛋白的表达或减少抗凋亡蛋白的产生有关[8]。同时各种HDAC抑制剂能刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，而抗氧化剂治疗会降低它们的抗癌活性。虽然ROS产生的最初来源仍不清楚，但氧化应激可能在HDAC抑制剂诱导的肿瘤细胞死亡中发挥重要作用，氧化应激可能激活线粒体通路激活细胞凋亡[9]。

丁酸钠可通过调节肝细胞中的miRNA-22进而促进细胞凋亡。miRNA-22在肝癌细胞或其他癌细胞中均有下调，miRNA-22的下调对肿瘤的增殖、分化有一定的影响。SIRT1在肿瘤细胞中表达量很高，SIRT1的表达可以调节细胞内的抗氧化剂(SOD)使细胞产生的ROS维持在一个平衡的水平[10]。丁酸钠处理肝癌细胞后会上调miRNA-22的表达同时靶向抑制SIRT1，SIRT1的抑制会影响抗氧化剂SOD的下调从而产生大量的活性氧(ROS)造成线粒体的损伤，Bcl-2含量下降激活内源性凋亡通路，线粒体释放细胞色素C引发下游caspase-9的表达最后活化caspase-3从而促进凋亡的产生[11]。

丁酸钠和派立福辛(perifosine，Per)联用可诱导白血病细胞凋亡。Per就是烷基溶血磷脂的一种；烷基溶血磷脂是一类新型的抗肿瘤药物，可靶向细胞膜诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞。Rahmani等人研究发现[12]丁酸钠和Per联用可以诱导U937、HL-60和jurkat白血病细胞的线粒体损伤，诱导细胞色素C和凋亡因子的释放、caspase-3/8的升高，显著抑制细胞生长，此外Nab和Per联合处理后还发现促凋亡蛋白Bax从胞质内转移到线粒体上，同时过表达Bcl-2会延缓Nab+Per所介导的凋亡。这意味着Nab和Per促进U937细胞的凋亡是通过激活线粒体通路而发生的。以上这些现象的机制与信号调节激酶(ERK1/2)通路和AKT通路的失活、JNK的激活、神经酰胺和活性氧(ROS)的增加有关，但JNK的激活并不起主导作用，同时神经酰胺的产生需要ERK1和AKT通路的失活介导。

胶质瘤相关癌基因同源物1(glioma-associated oncogene homolog,GiL1)是Gil家族中具有激活功能的主要转录因子，在多种肿瘤细胞中存在着Gil1的过表达，且GiL1的过表达可以显著促进肺腺癌细胞(A549)的增殖并抑制细胞凋亡。通过体内外试验发现[13]丁酸钠和多西他赛可以抑制Gil1的表达并上调BaX 、p21、Cyclin A、cleaved-caspase3表达，同时下调CDK1、CDK2、Bcl-2、Ki-67的表达，进一步抑制下游的细胞凋亡，这种情况在丁酸钠和多西他赛联合处理时更加显著。这提示丁酸钠单独用药抑制癌细胞增殖、并促进凋亡或提高多西他赛药物的敏感度是治疗肺腺癌的潜藏机制之一。虽然试验结果未能直接证明丁酸钠激活线粒体通路,但是Bax作为促凋亡的主要蛋白,其机制就是改变线粒体膜通透性释放细胞色素C，所以丁酸钠促进肺腺癌细胞凋亡机制可能与线粒体通路有关，这为治疗肺腺癌提供了新的思路。

MicroRNA(miRNA)可通过抑制mRNAs的翻译并降解其活性成为肿瘤治疗的潜在靶点，近年来有研究证明miR-139-5p的大量表达会影响肿瘤患者的预后效果，在膀胱癌细胞中的miR-139-5p表达量很低并且靶向调控Bmi-1可以起到抑制肿瘤的作用[14]。Bmi-1是PcG家族中的成员，在肿瘤细胞中高表达，其表达水平与肿瘤的侵袭、发展、预后有关[15]。丁酸钠处理膀胱癌细胞(T24和5637细胞)后会上调miR-139-5p的表达量，进而抑制下游Bmi-1的表达。Bmi-1的下调一方面可以抑制肿瘤细胞的迁移，另一方面还能造成线粒体膜的损伤产生过量的活性氧(ROS)，上调了caspase-3和PARP(凋亡标志物)的表达，抑制了Bcl-2的活性从而促进凋亡的产生；有趣的是，这种线粒体损伤同时也激活依赖AMPK- mTOR的自噬反应，当把这种自噬抑制后发现凋亡被抑制了；丁酸钠产生通过破坏线粒体膜产生过多的ROS来诱导凋亡；同时膀胱癌细胞中丁酸钠诱导的自噬抑制后会影响凋亡，这表明自噬也能调节凋亡[16]。此外丁酸钠处理神经瘤细胞后可以打开细胞的线粒体通透性的暂态孔隙(MPTP)造成质子泄露，造成线粒体膜电位损伤诱导了凋亡的产生[17]。

1.3 丁酸钠激活内质网应激诱导凋亡

丁酸钠可通过激活内质网应激诱导细胞凋亡。内质网广泛存在于真核细胞当中是合成和加工蛋白质的主要场所，同时也是Ca2+贮存的主要场所，内质网通路介导的凋亡主要是由于内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER-stress)引起的，当错误折叠蛋白和未折叠蛋白过多积累时，细胞激活未折叠蛋白反应(unfold protein reponse，UPR)可以诱导内质网应激下游的反应[18]。虽然丁酸钠对于调节内质网应激的研究相对较少，但有研究用丁酸钠处理慢粒白血病细胞株K562和阿霉素耐药的K562后发现细胞凋亡率显著上升，进一步研究中发现丁酸钠处理后的内质网应激相关蛋白BIP显著增加，这提示NaB诱导的K562细胞凋亡可能与内质网应激有关[19]。

2 影响丁酸钠诱导细胞凋亡的因素

2.1 细胞系影响丁酸诱导的凋亡

丁酸钠作用于不同细胞系会产生不同的效果。例如Mandal的研究证明了丁酸钠处理乳腺癌细胞后会下调Bcl-2的表达从而促进乳腺细胞的凋亡。NaB处理感染牛结核分枝杆菌(M.bovis)的THP-1细胞后发现，Bcl-2的表达下调，从而诱导高水平的凋亡[20]。然而，丁酸钠处理大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型细胞后可通过激活PI3K/Akt信号通路，减轻MCAO后神经细胞的凋亡[21]。LPS处理过的牛乳腺上皮细胞会诱导高水平的细胞凋亡，但使用NaB处理这类细胞后可以上调PI3K/AKT信号通路，降低caspase-3 等凋亡相关蛋白的表达[22]。前文中所提到的Nab和per联用处理白血病细胞会上调caspase-8、caspase-3和细胞色素C的表达量，但单独使用Nab处理细胞后，细胞色素C的含量并没有变化。这可能由于NaB并非直接影响白血病细胞释放cytC，而是通过上调促凋亡蛋白Bak和Bid。这可能和之前的试验结论有所出入，这种现象的原因可能是试验过程中所用的细胞系不同，例如在做丁酸钠影响人类肝癌细胞系HCC-T和HCC-M研究时，这种细胞系会产生大量的Bcl-2，可能会影响丁酸钠处理后的结果，此外肿瘤细胞系和正常细胞系也有较大的差异，总结发现丁酸钠处理肿瘤细胞系后往往会促进凋亡的产生，但对于丁酸处理一些致病菌感染或机能缺陷的正常细胞系时，细胞凋亡的水平表现出较大差异。

2.2 丁酸钠浓度影响丁酸钠诱导的凋亡

Zhang等人[23]的研究中表示丁酸盐在低剂量(2 mmol/L)时诱导HCT-116细胞自噬，在高剂量(5 mmol/L)时自噬水平相对较低，但高剂量处理过的细胞凋亡相关蛋白上调较大，诱导了高水平的细胞凋亡。使用高剂量的丁酸钠处理乳腺癌细胞MCF-7后会诱导高水平的凋亡，而中剂量处理时凋亡的产生相对较小[24]。综上可知，不同浓度的丁酸钠处理后的细胞可能诱导不同的反应。

即便等浓度丁酸钠处理细胞后，细胞内的准确浓度也无法判定，这种现象可归因于，线粒体通过β氧化可以快速的代谢丁酸。因此代谢丁酸速率快的细胞可能不太容易受到其诱导凋亡的影响，这解释了依赖丁酸为主要能源的结肠细胞不会受到高浓度丁酸的影响。在进行小鼠实验时往往将丁酸钠的血浆浓度定在10 mmol/L，虽然有些实验证明口服给药可以达到标准的血浆浓度，但都是通过灌胃的方法操作的，某些试验将丁酸钠和食物混杂在一起给药是无效的，因为动物采食过程中可能会忽略丁酸钠颗粒造成同组动物中丁酸钠血浆浓度有很大差异，这都会影响最后凋亡的强弱。此外与细胞实验相比，动物实验往往需要更高浓度的丁酸钠,这可能是与首过效应(first pass effect)有关。所有口服药物的吸收需要通过胃肠壁，然后进入门静脉，这种反应造成药物的代谢增强、吸收减少，治疗效果下降。

3 丁酸钠对实验动物模型的影响

越来越多的研究表明丁酸钠可以改变实验动物模型的生理状态。有研究表明[25]丁酸钠处理慢加急性肝衰竭的小鼠模型可降低小鼠血清中炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-18均显著下调，进而对小鼠模型起到保护作用。此外丁酸钠与小檗碱联合应用可对高脂饮食引起的C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病起到缓解作用。提取自中药的小檗碱长期以来一直用于腹泻的治疗，近年来，也被用于临床治疗高脂血症。丁酸钠和小檗碱联合应用可激活肝脏AMP依赖的蛋白激酶通路：脂肪合成基因的表达明显减少,而脂肪分解基因的表达明显上调,同时出现肝脏炎性因子表达减少。

丁酸钠在慢性肺部疾病起到一定的积极作用。研究证明[20]丁酸钠处理牛结核病小鼠模型后可显著减少小鼠肺脏的炎性灶，增加IL-1β的分泌，进而缓解牛分枝杆菌引起的感染。

丁酸钠在大鼠心肌缺血性损伤模型中表现出积极影响。有研究发现[26]丁酸钠降低心肌缺血大鼠梗死面积,对大鼠急性心肌缺血性损伤有保护作用。其具体机制为丁酸钠能够上调pkm2的表达,增强其活性,增加ATP的含量。Pkm2在心肌能量代谢和肿瘤的研究方面起到重要的作用，这提示丁酸纳对肿瘤动物模型也具有调控作用。也有研究发现丁酸钠处理黑色素瘤荷瘤的小鼠模型可以通过抑制肿瘤相关巨噬细胞的分化、增殖以及下调促瘤巨噬细胞因子而抑制小鼠肿瘤细胞的增长[27]。综上所述，丁酸钠在多种实验动物模型上起到一定的干预作用，为实验动物模型的发展提供理论依据。

4 总结和展望

丁酸钠不仅具有改善肠道菌群稳态、抗感染、抗氧化等生物学功能还是HDACi中的一种。丁酸钠主要通过影响线粒体、内质网应激以及死亡受体通路来诱导细胞凋亡(图2)。细胞凋亡在肿瘤等疾病的发生和发展具有重要作用；因此阐明丁酸钠对细胞凋亡调控机制，对于肿瘤及相关疾病的治疗与预防具有重要意义。丁酸钠还可以通过调节实验动物机体细胞因子的分泌及相关基因的表达影响疾病的发生和发展。当然丁酸钠的作用也远不止于此。未来的研究方向可以探究丁酸钠作为辅助药物提升抗肿瘤药物效果的分子机制，以及构建更多的实验动物模型，为医用丁酸钠提供理论依据。