动物实验中兔的不同处死方法的统计分析*

李硕磊 刘继超 张孟蕾 牛屹东

(北京大学人民医院 动物实验室，北京 100044)

随着人类社会文明的发展，动物福利越来越受到重视，实验动物“安乐死”也引起了广泛关注。“安乐死”(euthanasia)一词源于希腊文，意思是“幸福”的死亡。我国现有法规标准将“安乐死”称为“安死术”，科学技术部于2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》中就提出处死实验动物需要用安死术[1]。安死术是指用公众认可的、以人道的方法处死动物的技术。其含义是使动物在没有惊恐和痛苦的状态下安静地、无痛苦地死亡[2]。动物实验中除了最常用到的啮齿类动物外还会用到大量的兔，通过已有文献报道可知在实验动物的使用中，近些年来对啮齿类动物安乐死现状已有相关研究分析，而对兔的安乐死现状却鲜有报道，本文对知网数据库中筛选出的文献进行分析，并对国内外几种常用的安乐死方法进行了介绍与对比，旨在掌握国内近5年兔处死方法使用情况，以及“安乐死”执行情况，为研究及管理人员提供参考。

1 材料和方法

在知网数据库中，以“兔”“处死”和“兔”“安乐死”作为检索词对国内2017—2021年的文献进行检索，并按条件对检索出的文献进行筛选，筛选条件为：文献中开展了兔实验并将兔处死的文献。本研究对符合条件的文献中处死方法的使用情况、处死时是否使用麻醉以及“安乐死”执行情况进行了统计分析，统计分析采用 Excel软件。

2 结果

2.1 检索结果

按照方法中描述的检索方法，以“兔”“处死”和“兔”“安乐死”作为检索词，共筛选出368篇文献，符合研究条件的文献有367篇，其中有学术期刊174篇，学位论文189篇，特色期刊2篇，会议1篇，图书1篇。

2.2 处死方法

367篇文献中有52篇明确提出了兔处死方法，占所有文献的14.17%(52/367)。涉及空气栓塞法、颈椎错位法、过量麻醉法、颈动脉放血法和CO2窒息法等5种方法(表1)。有32篇文献使用了空气栓塞法，占61.54%(32/52)。文献中描述空气栓塞处死方法的术语有空气栓塞法、心脏空气栓塞法、耳缘静脉空气栓塞法、耳缘静脉栓塞法和耳缘静脉注射空气法；有12篇文献使用了过量麻醉法，占23.08%(12/52)。过量麻醉法使用麻醉药的种类有戊巴比妥钠，水合氯醛和速眠新，其中使用戊巴比妥钠的有8篇(剂量为3%戊巴比妥钠的有7篇，25%戊巴比妥钠的有1篇)，占15.38%(8/52)，使用水合氯醛的有2篇(剂量为10%水合氯醛的有1篇，没提到麻醉剂浓度的有1篇)，使用速眠新的有1篇，没有提到麻醉剂的有1篇；有6篇文献使用了颈椎脱臼法，占11.54%(6/52)。文中描述颈椎脱臼处死方法的术语有断颈窒息法、颈椎错位法和颈椎脱臼法。颈动脉放血法有1篇，占1.92%(1/52)。二氧化碳窒息法有1篇，占1.92%(1/52)。

2.3 符合相关法规、指南、标准推荐的安乐死方法

目前，国内公认的安乐死方法主要参考国科发财字[2006]398号《关于善待实验动物的指导性意见》、GB/T 39760—2021《实验动物 安乐死指南》、2020版《美国兽医协会 动物安乐死指南》。本研究使用空气栓塞法的文献有32篇，其中明确符合上述法规、指南、标准推荐的安乐死方法有1篇(非必要不使用该方法，如确实需要需麻醉后进行)在麻醉后进行，占空气栓塞法的3.22%(1/32)。使用过量麻醉法处死兔的有12篇，其中明确符合上述法规、指南、标准推荐的安乐死方法有9篇(包括8篇注射戊巴比妥钠和1篇注射速眠新)，占过量麻醉法的75%(9/12)。使用CO2窒息法的文献有1篇，符合上述法规、指南、标准推荐的安乐死方法。

经统计，在文献撰写中明确提及处死方法的52篇文献，符合上述指南、法规、标准推荐动物安乐死方法的文献共计11篇，占21.15%(11/52)。

2.4 “安乐死”一词的使用

在筛选出367篇较明确提出处死方法的文献，其中仅有23篇文献提到了“安乐死”一词，占6.27%(23/367)。

3 讨论

动物实验是生命科学研究中不可或缺的研究方法，实验中不可避免地会对动物产生伤害[3]。“安乐死”是实验动物福利的核心之一，实验者应在掌握了一定的专业技能后，在合适的时机采取恰当的方法对实验动物实施“安乐死”，最大程度地降低动物的痛苦[4]。本研究结果表明，我国科研人员的实验动物“安乐死”意识有所欠缺，并且在论文撰写过程中存在动物处死方法叙述不规范问题，本文就研究中发现的问题进行讨论并提出相应建议。

3.1 “安乐死”在论文撰写、福利伦理审查和发表审核方面被忽视

在本文调查的367篇文献中，仅有52篇文献明确提出了兔的处死方法，占14.17%(52/367)；23篇文献提到了“安乐死”一词，占6.27%(23/367)；11篇文献使用了符合相关法规、指南、标准的安乐死方法，占21.15%(11/52)。科研人员应加强相关法律法规的学习，按法规标准、指南要求对实验动物实施“安乐死”，科研人员所在单位福利伦理审查机构应加强对动物实验开展前的福利伦理审查和指导，并对实验开始后课题所涉动物实验进行监督、核查，学术杂志应加强审核，规范论文在这方面的撰写，促进动物“安乐死”的实施。

3.2 空气栓塞法是最常用的处死方法

空气栓塞法的具体方法是兔耳缘静脉注射20～40 mL空气，空气进入体内静脉，直至心脏、肺、脑等重要脏器，引起血液循环障碍，使其迅速死亡[5]。在美国兽医协会( American Veterinary Medical Association，AVMA) 指南中指出空气栓塞法不作为可接受的首选“安乐死”方法，在使用空气栓塞法“安乐死”的动物会出现抽搐、角弓反张、鸣叫等临床症状，这很大程度上增加了动物的痛苦，同时也会使实验者产生较大的心理压力，如果必须使用该方法“安乐死”动物时，必须先将动物麻醉[6]。本调查中有32篇文献选用了空气栓塞处死法，但在麻醉状态下处死动物的仅有1篇，占使用空气栓塞法的3.13%(1/32)，表明我国科研人员的“安乐死”意识较为欠缺，或为文中描述不足，也可能涉嫌违反动物福利相关法规和标准。空气栓塞法也有一定的优点，与过量麻醉法相比，其不会产生药物残留，避免了麻醉药对组织和器官的伤害，但是空气栓塞法必须在动物麻醉后进行，如考虑注射药物对实验的影响可考虑使用气体麻醉。

3.3 过量注射麻醉法(静脉注射戊巴比妥钠)是AVMA指南中首选推荐的兔安乐死方法

过量麻醉法属于化学方法，麻醉剂种类有吸入性麻醉剂(异氟醚、氟烷、CO2等)和非吸入性麻醉剂(巴比妥类药物等)。本调查中使用的非吸入性麻醉剂多为戊巴比妥钠。巴比妥类药物(以戊巴比妥钠为主)是AVMA指南中兔安乐死的首选推荐方法，但根据本调查结果发现该方法仅有15.38%(8/52)的使用比例。此外，使用速眠新麻醉致死的文献仅有1篇。水合氯醛作为镇静药和抗惊厥药物而非麻醉药，现国内外期刊已普遍不再建议使用水合氯醛进行动物麻醉。因此，符合安乐死方法的过量注射麻醉法仅占17.31%(9/52)。非吸入性麻醉法是指通过快速注射过量的麻醉剂，使动物中枢神经过度抑制而死亡，非吸入性麻醉剂有静脉、腹腔等多种注射方法，优先选择静脉注射。静脉注射大量麻醉剂可以迅速抑制呼吸中枢和心脏跳动，使动物安静地死去。兔麻醉处死一般采用耳缘静脉注射麻醉剂，但需要经过一定的专业训练才能熟练地找到血管并成功注射，并且雏兔血管较细，操作具有一定难度。静脉注射具有难度时，可以选择腹腔注射，但腹腔注射需要较大剂量的麻醉剂，而且动物的疼痛和死亡时间都会有所增加[7]，所以可以在麻醉剂中加入局部麻醉药以缓解腹腔注射带来的痛苦[8]。

3.4 颈椎脱臼法是较常用的安乐死方法

颈椎脱臼法属于物理方法，《实验动物安乐死指南》中指出使用颈椎脱臼法的条件为：(1)其他“安乐死”方法影响实验结果；(2)颈椎脱臼法可用于体质量低于200 g的啮齿类动物、禽类，以及体质量低于1 kg的兔。除非有特殊需求，实施颈椎脱臼前应当先给予动物镇定剂或吸入CO2，以减轻动物的痛苦；(3)操作人员应接受完整的技术训练，并以尸体多次练习后方可正式实施[9]。对于体质量大于1 kg的兔，即使是技术熟练的操作者也不能保证将兔颈椎完全脱臼，这时可以借助固定动物头部的特殊装置，通过拖拽后肢来完成颈椎脱臼[10]。本调查中有6篇论文使用了颈椎脱臼法处死动物，但没有1篇是在麻醉状态下实施的，且根据实验方案可知，实验中涉及的兔的体质量均超过1 kg。可以看出目前我国科研人员在涉及兔的实验中“安乐死”意识极为欠缺，并且可能存在操作严重不规范问题。

4 总结

随着人们认知的进步，实验人员在从事生命科学研究时越来越重视动物福利。动物福利是社会进步和经济发展到一定阶段的必然产物，体现了人与动物协调发展的趋势[5]。从动物种类、动物痛苦程度、实验需求和成功率方面考虑，结合实际情况，选择合适的安死术可以有效减轻动物临终前痛苦[11]，确保动物的临终福利得到保障。我国已经出台了《关于善待实验动物的指导性意见》、国家标准《实验动物安乐死指南》等与实验动物“安乐死”相关的法规和标准，但这仅是第一步，还需加强相应技术的培训与考核，加强福利伦理委员会的审查与监督，严格期刊杂志的投稿审核，提高科研实验人员动物福利的意识，熟练掌握安乐死方法，将动物福利落实到实处，落实在动物“安乐死”方法这一动物福利的核心点上，确保动物实验能够合规、合法完成，确保实验数据能够科学有效获得。