三阴性乳腺癌中AR与Ki-67、CK5/6的表达及相关性分析

王会华 常庆龙△ 崔萍萍 原阳

郑州大学第三附属医院 1)乳腺三科 2)科研中心 郑州 450012

乳腺癌(breast cancer，BC)是女性中发病率位居第一的恶性肿瘤，随着分子医学的发展，BC的分子分型也更加详细，针对不同靶点的治疗方案也逐渐发展。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中的一种特殊分子分型，其免疫组化特征是雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)均不表达。TNBC呈高度异质性，生物学行为侵袭性强，易早期复发，有较高远处转移、内脏转移及脑转移率，进展快，预后差。TNBC缺乏已知治疗靶点的受体表达，难以对这类患者进行相应的个体化治疗，这就造就了目前TNBC治疗方案缺乏的困境，故探讨TNBC的临床病理特征及其各生物标志物间的关系以发现有效的治疗靶点，已经成为近年临床研究的焦点。雄激素受体(androgen receptor, AR)在乳腺癌中广泛表达，目前认为其在乳腺癌变及癌细胞的迁移及侵袭过程中有重要作用，虽然具体作用机制仍需进一步研究，但TNBC中AR的阳性表达使AR有望成为TNBC的潜在治疗靶点[1]。细胞增殖指数(Ki-67)是一种肿瘤标志物，反映乳腺癌中癌细胞的增殖状态，常用于预测乳腺癌患者的预后。细胞角蛋白5/6(cytokeratins5/6，CK5/6)因在基底层细胞特异性表达的特点一般被用于诊断TNBC中的基底细胞样类型乳腺癌。有研究认为，AR通过调节PI3K的亚基激活TNBC细胞的迁移与侵袭[2]，而CK5/6与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)共表达，可以激活包括PI3K/AKT/mTOR等在内的一些下游信号通路[3-4]。本研究旨在探讨AR、Ki-67、CK5/6与临床病理特征的关系及其三者的相关性，以望能为TNBC的风险分级和基于分子格局的潜在治疗方案提供一些支持。

1 资料与方法

1.1研究对象回顾性分析2016-01—2020-12在我院经病理确诊且已行手术治疗的115例乳腺癌患者的临床资料，均为女性；年龄为 29～68岁，中位年龄49岁。肿瘤最大直径≤2 cm 29例，2～5 cm 86例。无淋巴结受累84例，淋巴结受累31例。组织学分级I～Ⅱ级48例，Ⅲ级67例。纳入标准：(1)均参照2015年的St-Gallen共识标准[2]判定为TNBC(ER、PR、HER-2均为阴性)。(2)术前均未进行放疗、化疗、靶向及内分泌等新辅助治疗。临床资料完整。排除标准：(1)合并高血压、糖尿病等基础疾病的患者。(2)初诊时有远处转移的患者。所有患者的病理切片在显微镜下重新由两位经验丰富的病理医师进行双盲独立阅片并得出明确诊断。

1.2免疫组化检测手术切除的肿瘤组织标本用10%的中性缓冲福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片。运用免疫组化SP法进行检测，以已知阳性切片为阳性对照，并以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。AR、ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6检测试剂均自上海罗氏公司购入，试剂盒为即用型试剂盒。

1.3病理结果判读(1) ER、PR判定标准：肿瘤阳性细胞数<1%则判定为阴性[5]。(2)HER-2判定标准：无着色或≤10的肿瘤细胞膜呈现微弱的、不完整着色为(-)，>10%的肿瘤细胞呈现微弱的、不完整着色为(+)，呈弱-中等的完整细胞膜着色的肿瘤细胞>10%或者呈强而完整的细胞膜着色的肿瘤细胞≤10%为(++)，呈强、完整且均匀的细胞膜着色的肿瘤细胞>10%为(+++)。HER-2表达(-)和(+)判定为阴性。(++)者行原位杂交荧光FISH检测以进一步明确是否存在扩增，无扩增判定为阴性，有扩增则判定为阳性。(+++)者判定为阳性。(3)AR判定标准：阳性细胞数<10%为(-)，≥10%为(+)。 (4)Ki-67判定标准：细胞核染色呈黄色或棕黄色颗粒的肿瘤细胞即阳性细胞，本研究选择以40%作为Ki-67分组的界值，阳性细胞率<40%为低表达组，阳性细胞率≥40%为高表达组[6]。(5) CK5/6判定标准：细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒的肿瘤细胞为阳性细胞，阳性细胞率≥1%判为阳性，<1%判为阴性。

1.4统计学分析采用SPSS 26.0软件进行数据处理。分类变量差异性分析用χ2检验及Fisher确切概率法，AR与Ki-67及CK5/6的相关性选用Spearman 相关性分析。以α=0.05作为检验水平。

2 结果

115例肿瘤标本中，AR表达阳性40例(34.8%)，表达阴性75例(65.2%)。Ki-67高表达98例(85.2%)，低表达17例(14.8%)。CK5/6阳性表达80例(69.6%)，阴性表达35例(30.4%)。见表1。组织学分级在Ki-67分组间的差异存在统计学意义(P<0.05)，组织学分级I～Ⅱ级的TNBC患者在Ki-67低表达组中的占比率高于Ki-67高表达组。患者的年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移在Ki-67分组间表达差异均无统计学意义(P>0.05)。患者的年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移在AR与CK5/6分组间表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。AR与Ki-67、CK5/6在TNBC的表达存在负相关关系，差异有统计学意义(r值分别为0.467和0.350，P<0.05)。见表3。

表1 各组计数及占比

表2 AR、Ki-67、CK5/6在TNBC的表达以及与临床病理特征的关系

表3 AR、Ki-67、CK5/6的关系

3 讨论

乳腺癌已成为女性发病率排名第一的癌症，TNBC是乳腺癌的一个亚型，占10%～15%[7-8]，是不同表型乳腺癌的异质性集合，目前尚无有效的基于分子标志物表达的治疗方案，因此发现TNBC的治疗靶点一直都是学者们关注的目标。分析TNBC分子标志物的表达特点及其各个分子标志物之间的关系是近年来研究的热点，有研究发现AR通过调节PI3K的亚基推动TNBC细胞的迁移和侵袭性，CK5/6可以激活PI3K/AKT/mTOR信号通路[2-4]，而Ki-67被普遍认为可以预测乳腺癌患者的预后。本研究探讨了TNBC中AR、Ki-67、CK5/6与临床病理参数之间的关系及其三者之间的相关性，以期为TNBC的进一步危险分级及为潜在治疗靶点提供理论支持。

AR广泛表达于乳腺癌中，不同分型表达率有所不同，同时也是一种预后指标。有研究表明，AR在TNBC中有维持细胞增殖的作用，与AR相似的ER、PR目前已作为ER和PR阳性乳腺癌内分泌治疗的靶点。AR被认为是TNBC很有希望的潜在治疗靶点，进一步进行探讨对改善TNBC的治疗效果具有重要的临床意义[9-12]。本研究中，AR(+)占比为34.8%，和其他研究结果相近[1，13-15]。TNBC患者的临床病理特征与AR表达之间无统计学意义的相关性，Asano、Payandeh等[16]的研究结果也证实了这一点。其他研究表明，AR的表达情况与组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移具有相关性[16-18]， AR阳性判定标准尚未统一，可能是研究结果不同的影响因素之一，同时参考文献中的研究对象并不全是同一种人种，也是需要考虑的影响因素。

Ki-67 是目前最常用的反映肿瘤细胞增殖状况的生物标志物，存在于细胞周期除G0期外的其他阶段，与肿瘤的发生、浸润、种植和转移过程相关[19]。TNBC中Ki-67的阳性表达率远高于其他分子分型。一项包含7 716名TNBC登记患者的荟萃分析研究表明，虽然目前Ki-67的最佳分界点仍不清楚，但以Ki-67的40%为界值可能可以更好区分不同死亡风险的TNBC患者[6]。以Ki-67的40%为分界点将Ki-67分组，本研究中患者的年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移与Ki-67表达无相关性，组织学分级与Ki-67表达存在相关性，与文献[20]的研究结果基本一致。

肿瘤组织CKs常被用来明确肿瘤是否为上皮来源，CK5/6常被用来细分TNBC的基底细胞样亚型，往往与预后不良有关[21-22]。本研究中CK5/6在TNBC中阳性表达占比为69.6%，在其他研究TNBC中CK5/6阳性占比率的范围之内[23]。患者的年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移与CK5/6无相关关系，这与金玉、刘中正等[22-23]的研究结果基本一致。

本研究通过Spearman相关性分析发现，AR与Ki-67、CK5/6在TNBC的表达存在显著的负相关关系，与周晨阳等[11,18，23]的研究结果基本一致。一项由Payandeh等[16]进行的研究认为AR表达状态与Ki-67表达状态无显著相关关系，这可能跟目前AR阳性判定标准及Ki-67在TNBC中的最佳截断值仍存在一定争议有关，不同地区人群及不同人种也有可能会影响结果。

本研究的局限性在于纳入研究的例数有限，以及患者的确诊时间问题未将AR、Ki-67、CK5/6与预后指标进行相关分析。这也是需要进一步研究的问题，我们希望本研究对于TNBC的风险分级以及预后评估有一定帮助，同时也需要更多更深入的研究，有望发现与之有关的潜在治疗方案。