破壁灵芝孢子粉中三萜含量的不确定度评定

金 雅，张春椿，蒋福升，包凯颖，李石清

(浙江中医药大学·浙江 杭州 310053)

不确定度一般使用统计学方法，通过定量研究的方式测量可信区间和分散性，其可对结果的可靠性进行决定，当实验所得到的不确定度越小，就代表了其所具备更高的测量水准[1]，同时也具备了更大的实用价值。近年来，由于科学技术的快速发展，人们对于实验中检验结果的可靠性和精确度的要求也在不断提升，使得测量不确定度受到了越来越多人的关注及重视。含量测定是药品质量控制的重要内容[2]。按照2020年《中国药典》[3]制订大纲的需求，国家药典委颁发《药品检测结果不确定度评定指导原则》(征求意见稿)。由此，针对药品评定不确定度测量办法的落实和建立，不但有利于提升药品的检测品质，还便于国际之间的相互合作，在实验过程中具有重要的地位。

灵芝(Ganodemalingzhi)在最早的本草著作《神农本草经》中对其就有记载，是一种珍贵的药食两用型真菌[4]，具有平喘止咳、安神补气的效果。灵芝孢子为灵芝生长后期所形成且释放的种子，含有其所有活性遗传物质[5]，是其精华存在。对灵芝孢子破壁处理是由于灵芝孢子具备坚韧的质地，其所含有的高分子物质不能在水中溶解，并且具备耐高温、耐酸碱、耐压的特性，针对消化酶特别的稳定，从而导有效物质难以被吸收，由此针对其进行破壁处理可以更好地使灵芝孢子发挥药效，这也是最有效的渠道和途径[6]。灵芝三萜类在2020版《中国药典》中作为评价灵芝质量的重要指标之一，但对于破壁灵芝孢子粉却未被收载。在查阅有关文献[7-15]并结合所学知识，以相关标准、指南[16-17]为原则，本文通过UV-Vis对破壁的灵芝孢子粉中所含三萜含量进行研究分析并测定，通过不确定度评价的方式分析破壁灵芝孢子粉内的三萜含量，对最终测量结果的准确性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 破壁灵芝孢子粉：大盘山药业有限公司。齐墩果酸(批号：B20954)、香草醛(批号：S30213)均购于上海源叶生物科技有限公司。高氯酸、甲醇、乙醇、冰醋酸、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。

1.2 仪器 XS105型电子天平：梅特勒-托利多；UV-3600紫外可见分光光度计：岛津公司；HH-8数显恒温煮沸锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；TD5A-WS医用离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；G-060S超声波清洗机：深圳市歌能清洗设备有限公司；DHG-2150B电热鼓风干燥箱：郑州生元仪器有限公司。

1.3 标准品溶液的制备 将对照品(齐墩果酸)进行烘干直到恒重，精密称量20.0 mg，放置在100 mL容量瓶内，加入适量的甲醇予以溶解，再添加甲醇到达定容的刻度处，配制得0.2 g/L浓度的标准溶液。

1.4 供试品溶液的制备及测定 将样品(破壁灵芝孢子粉)进行烘干直到恒重，精密称量0.5 g，放置在50 mL容量瓶内，添加适量无水乙醇溶解后，再用其定容至刻度处，运用超声提取2 h，在此期间经常摇动，再通过离心机3 000 r/min离心10 min，最后获取其上清液，即得供试品溶液。精密吸取0.3 mL供试品溶液，放入10 mL具塞试管中，按“1.5”项下所描述的进行吸光度的测定，计算三萜类含量。

1.5 标准曲线的绘制 分别精密吸取浓度为0.2 g/L的标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL，将它们分别放置在10 mL的具塞试管中，然后再放入到沸水浴蒸干溶剂后加入0.40 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液以及1.6 mL高氯酸，加塞。并将其放置在60 ℃的水浴内恒温加热15 min处理，取出后立刻放置在冰水浴中冷却5 min，添加8.0 mL乙酸乙酯，摇晃均匀。以空白试剂溶液作为参比，于555 nm波长处测定吸光值。

2 结果

2.1 不确定度的评定

2.1.2 不确定度的来源分析测量方法 主要步骤为称量取样，通过对破壁灵芝孢子粉的样品进行提取、定容、制备标准系列、仪器分析及被测量的数学模型分析，见图1。本实验中其所含三萜含量测定不确定度的主要来源：样品称量时所引起的、样品处理过程中所生成的、样品在制备过程中体积各种因素导致的变化而引起、试样测定过程因多次实验(重复性)所产生的以及标准曲线进行拟合所引起的。

图1 不确定度来源

2.1.3 供试品样品量m0的标准不确定度u(m0) 针对m0测量所引入的标准不确定度分量u主要来源于3个因素：a)测量重复性uA(m0)；b)测量不准uB1(m0)；c天平分辨率uB2(m0)。uA(m0)：同一样品在同一时间内称量10次，测得结果为：0.4 999，0.5 000，0.5 001，0.4 998，0.5 002，0.5 000，0.5 000，0.4 999，0.4 999，0.5 001。标准偏差slo.00012 g1根据贝塞耳公式：

天平自身在称量环节过程中涵盖了不确定度的2个方面，即其线性和灵敏度。同一台天平下，在较窄的区间范围内先后进行两次称量，可忽略其质量差值灵敏度变动。齐墩果酸的质量m，通过选取利用分辨率为0.01mg，且其最大允许误差为±0.01mg的电子天平测量。运用了配衡体称量法称量2次，即由一次回零(空瓶)称量所得：m=m2-m1，其中m1为在没有装标准品齐墩果酸情况下100 mL容量瓶的质量(g)；m2表示在装有标准品齐墩果酸的情况下100 mL容量瓶的质量(g)。

m1测量引入的标准不确定度分量u(m1)，见表1。

表1 m1测量引入的标准不确定度分量

2.1.5 不确定度uC(V) 评定 利用100 mL容量瓶配制标准溶液所产生的不确定度uC(V) 评定主要有3个方面：测量的重复性uA(v)； 容量瓶允差uB1(V)；温度系数uB2(V)。

uB2(V)：溶液和容量瓶温度与校正时温度的区别所导致体积方面的不确定度，环境的温度是20±4℃，针对甲醇体积膨胀系数为0.00 119/℃，在置信区间内当置信概率达到95%，可计算出体积变化的不确定度：

因此合成其标准不确定度：

标准溶液相对合成标准不确定度：

表2 最小乘法拟合齐墩果酸质量-吸光度表

表3 破壁灵芝孢子粉中测得三萜的吸光度及含量

由以上计算，然后再根据下列公式从而可以得到标准曲线所产生的相对不确定度为：

2.1.7 供试品体积引入的不确定u(V) 针对供试品体积所产生的不确定度u(V)进行分析可知，它主要是来自于定容的过程。在样品处理中使用大小为0.5 mL的分度吸量管，其主要产生的不确定度来源由分析可知存在于以下的3个部分： a.分度吸量管体积u(V1)；b.测量的重复性u(V2)；c.校准和温度的影响u(V3)。

u(V1)：根据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》[18]相计量要求， A类0.5 mL分度吸量管吹出式仪器的容量允差为±0.005 mL。按均匀分布转换为标准偏差：

u(V2)：分度吸量管重复测定8次，其变动性标准偏差计算得u(V2)=4.3×10-4

合并三项得出的不确定度为：

2.1.8 A类试样测定过程中因测量重复性因素所产生的不确定度uA(x)

对样品进行6次单独测定，得数据见表4。

表4 样品含量测定

通过以上计算，可以得到因测量重复性因素所产生的不确定度：

2.1.10 合成不确定度

uc(x)=2.81×10-2×8.48=0.24%

2.1.11 扩展不确定度取包含因子k=2，扩展不确定度：Uc(x)=uc(x)×2=0.24×2=0.48%

2.1.12 测量不确定度的报告与表示样品中三萜的含量为：w=(8.48±0.48)%,k=2.

3 讨论

本实验通过UV-Vis测定破壁灵芝孢子粉中三萜的含量，并且通过建立数学模型对测量过程引入的不确定度进行分析与评估，通过实验结果可知，其合成不确定度为0.24%，扩展不确定度为0.48%，样品中三萜的含有量为(8.48±0.48)%。在实验过程的不确定度来源主要是标准品和供试品的过程，实验过程使用的仪器以及外界温度等因素也均会影响试验结果的准确性。因此，在实验中选择高精度的器皿，增加取样量，均可以减小各个步骤中的不确定度分量，有利于提高实验结果的可靠性，可为同类型实验提供一定的参考依据。