油葵苗期抗旱相关性状的QTL定位及候选基因筛选

石慧敏，侯建华，苏飞燕，王艳霞，李丹丹，周佳岭

(内蒙古农业大学 农学院， 呼和浩特 010019)

干旱是世界范围内限制农作物产量的主要因素之一[1]。在干旱频发地区，种植耐旱性较强的作物显得尤为重要[2]。向日葵是干旱半干旱地区一种十分重要的油料作物，根系发达，具有良好的抗旱潜力[3-5]，但其分布和产量仍受干旱的影响很大[6-11]。苗期是向日葵生长发育的关键时期，苗期受旱对向日葵形态建成、生长发育以及后期产量和品质形成都具有很大的影响，因此开展向日葵苗期抗旱性的研究至关重要。由于农作物抗旱的遗传机制非常复杂，因此常规育种方法在该领域若想取得重大进展比较困难[12]。近年来，分子标记技术已成功地应用于数量性状位点的鉴定(QTL)，且在挖掘作物对干旱胁迫响应的重要性状基因位点中已经有广泛的应用[12-13]。HERVÉ等[14]报道了4个叶绿素浓度QTL和1个相对含水量 QTL，分别解释了53%和9.8%的表型变异。Nishtman等[15]从PAC2×RHA266杂交的123个自交系及其亲本中选取70个自交系为材料，在淹水状态下分别检测到叶绿素浓度和相对含水量的3个和6个QTL。在水分胁迫条件下，鉴定出7个和2个QTL。并发现叶绿素浓度和相对含水量的QTL在连锁群10和16上存在重叠现象。最终认为两种水分条件下不同性状的共同QTL位点在连锁群10上显得更为重要。张永虎[16]构建了1张包含17个连锁群并分布有738个标记的遗传连锁图谱，两种水分处理下检测到30个QTL。尽管前人对向日葵干旱胁迫的研究取得了一定的进展，但是由于上述用于QTL定位的遗传图谱所涉及到的标记数量少、密度低，因此无法揭示向日葵耐旱性的综合遗传机制。随着向日葵基因组的公布，为挖掘向日葵抗旱相关的重要候选基因提供了可能。

基于此，本研究利用前期构建的高密度分子标记遗传连锁图谱，通过对150个株系组成的重组自交系群体苗期抗旱相关性状的表型及遗传统计分析，进行了QTL定位和候选基因的挖掘，为油葵遗传改良奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验所用材料，是内蒙古农牧业科学院提供的2个亲本材料K55(弱抗旱性)和K58(强抗旱性)，杂交后由内蒙古农业大学通过单粒传法构建的150个株系组成的F7代重组自交系群体。

1.2 材料种植和指标测定

2018年春季，选择籽粒饱满的向日葵种子，用氯化汞溶液消毒浸泡5 min，用蒸馏水多次冲洗，在水分合适的培养皿内室温催芽2 d，种植于塑料盆(250 mm×190 mm×160 mm)，每盆中装4 kg土壤(75%砂：20%营养土壤：5%蛭石)，种植前浇透水，每盆留苗8株，置于内蒙古农业大学人工智能温室中。温室内的温度设置为25 ℃，湿度设置为40%。试验设置干旱胁迫和正常浇水(对照)2个处理，每个处理设置3个重复。在向日葵幼苗生长到3片叶时开始进行干旱胁迫处理，胁迫期间每3 d 测定1次土壤含水量，干旱胁迫土壤含水量控制在5%～10%，正常浇水土壤含水量控制在15%～20%，对照条件下以最高土壤含水量20%，胁迫条件下以最高土壤含水量10%来计算每次浇水量，浇水量=(土壤最高含水量-土壤测定含水量)×土壤风干重量，土壤含水量和浇水量见表1。

表1 土壤含水量及浇水量对照表

胁迫15 d之后，每个材料随机选取5株，对正常浇水和干旱胁迫两种水分条件处理下的向日葵幼苗的叶片相对电导率、叶绿素含量、叶面积、叶片相对含水量、根长共5个性状进行测定。根长用根系扫描仪(万深 LA-S) 测定，叶绿素含量(SPAD值)使用叶绿素仪(TYS-A) 测定，叶面积用叶面积系数法测定，叶片相对电导率用DDS-11A电导仪测定；采用饱和称重法测定叶片的相对含水量[17]，计算公式为：

RWC=[(Wf-Wd) / (Wt-Wd)]×100%

其中，Wf为叶片鲜重，Wd为叶片干重，Wt为被水饱和后的叶片重量。

1.3 数据统计分析

运用Excel 2019软件对表型数据进行录入整理，利用SPSS23.0软件进行表型性状分析、相关分析等，利用JoinMap4.0，采用CIM(复合区间作图法)定位方法对向日葵幼苗性状进行QTL定位。

1.4 QTL定位

本研究定位所使用的高密度遗传连锁图谱是吕品等[18]于2017年以油用向日葵强抗旱自交系K58为父本，弱抗旱自交系K55为母本进行杂交获得150个F7重组自交系(RIL)群体所构建的。该图谱包含4 912个SNP标记和93个SSR标记，分布于向日葵17个连锁群上，总长2 425.05 cM，相邻2个标记间的平均距离0.49 cM。 采用JoinMap4.0软件对RIL定位群体的所有基因型数据进行连锁分析。使用复合区间映射(CIM)方法[19]来识别QTL。用PT检验1 000次设定阈值，首先考虑0.99置信度对应的LOD阈值，若没有定位区间则考虑0.95置信度对应的LOD阈值；若没有定位区间则考虑0.90置信度的阈值。若仍没有结果则没有考虑PT检验的结果，手动降低阈值到3.0；若3.0没有区间则降到2.5或2.0。检测到的各性状QTL位点命名方法为：q+所测性状的英文名缩写+连锁群位置+QTL编号。

1.5 候选基因筛选

利用遗传连锁图谱中的所有SNP和SSR标记，确定了物理图谱和遗传图谱的比对关系。在基因组上检测到的与QTL的置信区间一致的区域被认为是QTL区域，位于QTL内的基因被定义为QTL的候选基因，如Chao等[20]的方法所述。本研究选择扫描标记区间内基因组区域对应的候选基因，以2017年发布的向日葵基因组作为参考基因组进行比对[21]，并利用GO、KEGG、COG、NR、pam、Swiss-Prot等数据库进行功能注释。

2 结果与分析

2.1 表型性状分析

图1显示，两个亲本和RIL群体中的150个材料在正常浇水和干旱胁迫条件下5个抗旱相关性状的正态分布结果。从图1可以看出，所有性状均呈连续分布，且呈现正态分布或偏正态分布，符合QTL定位的要求。

从表2可以看出，在正常灌水条件下，两亲本间的平均值差异不是很明显；强抗旱种质K58叶片相对电导率、叶绿素含量、叶片相对含水量、叶面积和根长等5个性状均高于K55(弱抗旱种质)，RIL群体的变异系数为7.6%～45.4%。在干旱条件下，K58(强抗旱种质)的所有性状也均高于K55(弱抗旱种质)，RIL群体的变异系数在12.0%～42.2%之间。

表2 正常浇水和干旱胁迫条件下亲本和RIL群体各性状指标

从表3可知，正常浇水条件下，叶片相对电导率与叶绿素含量呈极显著正相关，与叶片相对含水量呈显著性负相关，但未达到极显著水平；干旱胁迫条件下，叶片相对电导率与叶绿素含量仍呈极显著正相关；此外，根长与叶面积呈显著性正相关，但未达到极显著水平。

表3 正常浇水和干旱胁迫条件下RIL群体各性状间的相关分析

2.2 QTL定位

两种水分条件下向日葵苗期抗旱相关性状的QTL定位结果显示，在RIL群体中共有11个QTL位点，正常浇水条件下5个QTL，干旱胁迫条件下6个QTL。定位于5号连锁群上的位点最多，为3个QTL位点。各性状的表型贡献率处于0.768%～7.547%之间(表4，图2)。

表4 两种水分条件下苗期各性状的QTL定位结果

正常灌水条件下检测到的5个QTL位点中，叶片相对电导率、叶绿素含量、叶面积、叶片相对含水量和根长各检测到一个QTL位点。位于第16连锁群上与叶片相对电导率紧密关联的qCCn-16-1位点LOD值最大，为4.271，表型贡献率为5.765%；第5连锁群上与叶绿素含量紧密相关的qLRCn-5-1位点表型贡献率最大，为7.547%。

干旱胁迫条件下检测到的6个QTL位点中，叶片相对含水量检测到2个位点，叶片相对电导率、叶绿素含量、叶面积和根长各1个QTL位点。位于第8连锁群上与叶面积紧密相关的qLA-8-1的位点表型贡献率最大，为6.705%；位于第16连锁群上与叶绿素含量紧密相关的QTL位点LOD值最大，为4.204。

2.3 与干旱相关的候选基因

本研究将检测到的位点对应的QTL区间序列与NCBI上发表的向日葵基因组[21]进行比对，利用GOG、GO、KEGG、NR等数据库对候选基因进行基因功能注释。COG(同源蛋白簇)主要注释到以下几条：3条参与翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣；1条参与脂质运输和代谢；5条参与无机离子的运输与代谢；3条参与信号转导机制；1条参与翻译、核糖体结构和生物发生；1条参与防御机制；1条参与复制、重组和修复；1条参与次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢；3条参与碳水化合物的运输和代谢；1条参与辅酶的运输和代谢。在两种水分条件下，共注释和筛选到62个重要的候选基因，候选基因位于3个连锁群(8、13、16)的3个QTL内，与3个性状(叶片相对电导率、叶面积、叶绿素)相关(表5)。

表5 与干旱胁迫相关的重要候选基因

续表5 Continued Table 5

基于基因功能注释，发现许多基因与干旱胁迫有关。位于8号染色体上的QTL qLA-8-1区间内的候选基因rna22964编码热击蛋白90-5，该基因参与翻译后修饰和蛋白质更新；rna23294编码WRKY转录因子2；rna22215编码细胞色素P450 90A1；rna23271编码细胞色素P450 82G1；rna23019和rna23004均编码乙烯反应性转录因子RAP2-7；rna22100编码E3泛素蛋白连接酶RHC2A；rna22868编码WRKY转录因子26；rna22783编码水通道蛋白TIP2-1，参与碳水化合物的运输和代谢；rna22224编码脯氨酸转运蛋白3；rna22878编码细胞色素P450 71A1；rna22577编码小热激蛋白；rna22661和rna22193分别编码脱落酸受体PYL2和PYL4；rna22948编码ABC运输者G家庭成员31。位于13号染色体上与叶绿素含量紧密关联的QTL位点qCC-13-1区间内的候选基因rna40140编码水通道蛋白TIP4;1，参与碳水化合物的运输和代谢；rna40077编码ABC转运蛋白G家庭成员15，该基因参与防御机制。位于16号染色体上的QTL位点qCCn-16-1的区间内的候选基因rna49909编码光调节蛋白。

3 讨 论

3.1 表型性状分析

作物抗旱性是一种综合性状，单一指标往往不具有代表性。因为所有单个抗旱的生物学过程最终都将反映在植物生长及其最终产品(产量)上[22]，因此，选择多个指标来综合评价作物的抗旱性才较为客观。本研究选取了5个与向日葵抗旱相关的指标进行QTL定位；干旱胁迫下，K58所有性状均高于K55，说明K58具有较强抗旱性。此外，本研究利用5个与抗旱相关的性状对RIL群体进行抗旱性评价，但是有些性状间相关性不大，这可能是试验误差造成的。由表2可以发现，两种水分条件下叶片相对电导率与叶绿素含量均呈极显著正相关，且干旱胁迫下，相关系数增大，说明二者与干旱胁迫具有密切的关系，因此认为这两个指标是衡量向日葵干旱胁迫的重要指标，这与张海燕等[23]在甘薯中的研究结论一致。

3.2 油葵抗旱性的遗传基础和QTL

近几十年中，QTL定位是植物数量性状位点挖掘中十分重要的方法之一，并且已经开发了多种遗传结构不同的群体进行定位。RIL是永久性分离群体，故常作为 QTL定位群体[24]。在本研究中，对RIL群体进行表型分析，并在正常浇水和干旱胁迫两种条件下对油葵苗期的5个抗旱相关性状进行QTL定位，共检测到油葵5条染色体上与抗旱相关的11个QTL位点。位于8号染色体上与叶面积紧密相关的2个位点qLAn-8-1和qLA-8-1在两种水分条件下被重复检测到，表明所检测到的QTL是稳定的。尚未定位到与前人研究一致的抗旱相关性状的QTL位点。本研究在干旱条件下于5号染色体检测到与叶片相对含水量相关的QTL，HERVÉ等[14]于5号染色体上也定位到了控制叶片含水量相关的1个QTL位点。Nishtman ABDI等[15]在正常浇水和干旱条件下分别在16号染色体上定位到控制叶绿素含量1个和2个QTL，而本研究也在正常浇水条件下也于16号染色体上检测到1个控制叶绿素含量的QTL，这2个性状虽然与前人研究定位到同一个染色体上，但物理位置却不相同，QTL标记区间的差异可能是由于图谱之间的标记种类和密度不一致所造成的。此外，qLRWC-5-1、qLRWC-5-2和qLRCn-5-1均定位于5号染色体上；qLRC-16-1和qCCn-16-1均定位于16号染色体上，qLRWCn-17-1和qRL-17-1均定位于17号染色体上，这些QTL之间虽然控制着不同的性状，但是却定位到同一染色体上，这些结果从各性状间的相关分析中也可以看出，两种水分条件下叶片相对电导率与叶绿素含量均呈极显著正相关；正常浇水条件下叶片相对电导率与叶片相对含水量呈显著性负相关，由此也可以看出相关性较高的性状间，可能是由同一染色体调控的，且该结果与Nishtman等利用RIL群体在水分胁迫下获得的结果一致[15]。

3.3 候选基因

从大量候选基因中选择重要的候选基因往往是一项困难的任务，然而，QTL信息和基因表达变异的整合是一种常见策略[25-26]。在此基础上本研究推测了一些可能与干旱胁迫密切相关的重要候选基因。位于8号染色体上与叶面积紧密关联的QTL位点上注释到的rna23019和rna23004均编码乙烯反应性转录因子RAP2-7；Somayeh Najaf等[27]对向日葵的AP2/ERF基因进行全基因组识别后，选取9个AP2/ERF基因，通过qPCR验证所选基因在不同非生物胁迫条件下叶片和根组织中的表达情况证实AP2/ERFs基因能有效抵抗非生物胁迫。rna22661和rna22193分别编码脱落酸受体PYL2和PYL4；已知PLY参与ABA响应干旱胁迫的信号传导过程[28]。研究发现ABA受体PYL4先前被检测到参与了植物对各种胁迫的响应。过表达TaPYL4可以提高小麦的抗旱性[29]。rna23294编码WRKY转录因子2，研究发现CsWRKY2参与了茶树的干旱胁迫，当使用外源ABA后CsWRKY2的表达得到了增强，当使用ABA合成抑制剂时，CsWRKY2的表达受损[30]。另外，ThWRKY2可在干旱胁迫下启动ThERF1(乙烯响应因子)基因的表达，该基因编码一种新的乙烯响应因子，并且对干旱胁迫在内的非生物胁迫进行负调控。在芥菜中过表达ThERF1增加了植物的蒸腾速率，导致植物对干旱胁迫更敏感[26]。rna22783和rna40140分别编码水通道蛋白TIP2;1和TIP4;1。有研究结果表明，HvTIP2;1和HvTIP4;1在大麦对干旱胁迫条件的适应过程中具有重要作用[31]。另有研究者在水稻中发现OsTIP2;1在根部强烈表达，几乎没有在叶片中表达，这说明水通道蛋白调控生理过程使植物获得抗旱性可能具有特异性[32-33]。

下一步，我们将开展精细定位，对这些候选基因进行克隆和功能鉴定，并通过群体的扩大等途径，继续发掘与其他性状相关的候选基因，为加强向日葵种质资源中优异基因的深度发掘和其在育种中的利用奠定基础。

本研究表明叶片相对电导率和叶绿素含量可以作为向日葵苗期抗旱性评价的重要指标。此外，本研究对向日葵苗期抗旱相关的5个性状进行QTL定位，于两种水分条件下共得到11个QTL位点，并对这些位点对应的基因组区域进行候选基因的功能注释，共筛选到62个与干旱胁迫相关的候选基因，这些基因可作为后期重点研究的对象。