基于傅里叶变换-离子回旋共振质谱的离子碰撞截面测量方法及应用

张凯林，徐诗音，焦鲁杨，杜梦颖，燕 昊， 毛钢钢，李树奇，孔祥蕾,3

(1.天津理工大学生命健康智能检测研究院，天津 300384； 2.南开大学化学学院，元素有机化学国家重点实验室，天津 300071； 3.南开大学化学科学与工程创新中心，天津 300071)

生物分子的结构可以决定其活性和功能[1-2]，其离子的三维结构信息在复杂样品分析中的重要性日益突出。常规的三维结构分析方法(如吸收光谱、核磁共振以及X-射线衍射等)难以在气相离子结构分析中发挥作用。碰撞截面(CCS)与分子结构直接相关，可用于表征离子构象和区分同分异构体。离子CCS的大小决定了其在真空中与中性分子之间的碰撞概率[3]，大多数离子CCS的测定通过离子淌度(IMS)实现[4-6]，IMS仪器与质谱仪的联用可以获得离子结构与质量信息[7-8]。基于质谱在分析速度、灵敏度和精确度等方面的优势，其已成为分析复杂样品的重要手段。除了表征离子的质荷比信息，质谱已被广泛开发并应用于分子结构研究和异构体区分[9-16]。基于质谱仪器的分子结构表征方法主要使用串联质谱分析策略[17]，如使用碰撞诱导解离[18-19](CID)、电子捕获/转移解离(ECD/ETD)[20-21]、红外多光子解离(IRMPD)[10, 22-23]及紫外光解离(UVPD)[24-25]等方法将离子解离，进而研究离子的结构和化学性质。

傅里叶变换-离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)具有较高的分辨率和较强的离子操控能力。带电离子在磁场中的回旋运动引起镜像电流的变化，通过测定离子的回旋频率即可获得质荷比信息[26-28]。在20世纪60年代(FT方法被应用于ICR质谱之前)，研究人员已经意识到使用离子回旋共振线宽能够实现甲烷等小分子CCS的测量[29-30]。受限于超导磁体技术的制约，实验使用的磁场强度不超过1 T，离子被激发后的动能较低，使得这一方法的应用非常有限。随着高性能FT-ICR MS以及软电离技术的发展，磁场强度及分析池的半径被不断提高，离子被激发后的动能随之提高，新的碰撞模型被提出并得以应用。同时，研究对象从小分子扩展到生物大分子，显示出其广泛的应用前景。

本文将系统地梳理2012年至今FT-ICR MS测量离子CCS相关的研究报道，总结通过FT-ICR MS测量离子CCS的物理模型和实际测量手段，并讨论相关方法的优缺点，最后对其应用前景进行展望和评述。此外，质谱仪器测量离子CCS的方法也被应用于其他类型的质谱仪，如四极杆[31-32]和轨道阱质量分析器[33-34]。

1 离子-中性碰撞模型

离子阱中发生的气相离子与中性气体分子之间的碰撞与离子捕获效率、质量分辨率、离子寿命等高度相关[35]。碰撞概率取决于离子阱中气体压强、离子空间构型以及相对运动速度，也可能与碰撞气体的种类相关。离子-中性碰撞模型是傅里叶变换质量分析器测量离子CCS的重要理论依据，该模型为FT-ICR MS镜像电流与离子CCS之间建立了联系。但对于不同的仪器，或在不同的仪器运行条件下，离子与中性离子碰撞时所适用的理论模型也不同。随着仪器和相关方法的不断发展，相应的理论模型也需要进行更新或调整。本节将简要讨论郎之万碰撞模型[36]、硬球碰撞模型[37]、高能硬球碰撞模型[38]这3种理论模型的物理意义和适用条件，并比较3者的不同。

郎之万碰撞模型将离子作为1个没有维度的点电荷，而将中性分子作为1个由离子诱导的偶极子，将离子-中性碰撞作为离子-偶极子之间的相互作用。硬球碰撞模型将离子抽象为1个球，并忽略离子与中性分子之间的极化力，用于描述具有相对更大动能或更高质量的离子-中性碰撞过程[37]。在硬球碰撞模型中，离子的CCS是常数，碰撞概率与离子速度成正比，其物理意义在于假设离子在裂解或退相干即失去相位匹配之前经历了多次碰撞，则离子-中性碰撞依旧可视为摩擦阻尼力，离子受到的阻尼力与离子速度的平方成正比。上述2种物理模型主要适用于较低能量碰撞且相对分子质量较小的情况。

为进一步提高FT-ICR MS的质量分辨率，有报道[39]采用更高强度的磁场以及更大尺寸的ICR分析池，离子被激发后在强磁场中做回旋运动的半径更大、速度更快，传统的用于描述低能碰撞的理论模型难以适用。因此，Guo等[38]提出了适用于描述更高能量碰撞的高能硬球碰撞模型。高能硬球碰撞模型将离子视为1个具有实际物理维度的球，CCS为其固有的物理常数，该模型假设每次碰撞都会导致离子云中的1个离子解离或退相干，使ICR信号电流减弱。高能的离子-中性碰撞会导致FT-ICR MS检测到的某个离子镜像电流随时间呈指数衰减。通过计算离子随时间的指数衰减系数，可计算得出相应离子的CCS。

通过FT-ICR MS的镜像电流准确测量离子CCS的关键在于选择合适的理论碰撞模型。3种碰撞模型中，分析池中的正空度会对信号的衰减率产生较大影响，较高的气压会导致信号的快速衰减，在对镜像电流的检测过程中可发现信号持续时间很短。频域峰的线宽与缓冲气的压力在高能硬球碰撞模型下呈近似线性相关[38]，但在硬球碰撞模型下呈非线性相关[40]。郎之万碰撞模型下离子的CCS与其动能相关；另外2种理论模型中CCS则被设为常数，用来描述离子在空间中的维度。郎之万碰撞模型应用于低能碰撞场景，与硬球碰撞模型相比，测量到离子的CCS值偏小；硬球碰撞模型则应用于离子质量更大的体系，离子与中性分子间的极化力可忽略。物理模型的选择还需考虑ICR分析池的物理参数(尺寸)以及FT-ICR MS的操作环境(磁场强度)。Guo等[38]提出的基于3种模型使用FT-ICR检测细胞色素c和泛素蛋白离子的应用范围示于图1。考虑到目前FT-ICR MS的磁场强度大多为7.0 T或更高，在激发半径较大时，使用高能硬球碰撞模型检测到的离子CCS更加准确。3种不同碰撞模型的对比情况列于表1[41]。

2 使用FT-ICR MS测量离子CCS的数据分析方法

2.1 频域分析方法

2.1.1频域峰线宽直接计算法 2012年，Yang等[40]使用FT-ICR MS测量离子CCS，并将该方法得到的碰撞截面定义为傅里叶变换离子回旋共振碰撞截面(CRAFTI)。该实验在1台磁场强度为4.7 T的FT-ICR MS上开展，为消除空间电荷[42]和非线性场[38]的影响，需要较高的背景中性气体分子密度，因此，需要增加ICR分析池中的气压，这种情况被称为压力主导。在检测离子CCS时，使用脉冲泄漏阀升高背景环境气压，从而确保在相对较低的真空水平下大部分离子在短时间内经历多次碰撞，ICR信号也会快速衰减。离子的CCS值可根据式(1)计算得到：

注：a.细胞色素c；b.+7价泛素蛋白图1 3种理论碰撞模型的应用范围[38]Fig.1 Suitable application regions of different collision models[38]

表1 3种离子-中性碰撞模型对比Table 1 Comparison of three ion-neutral collision models

(1)

式中，fwhm为单个质谱峰的半峰宽，m为待测离子的质量，M为碰撞气的相对分子质量，n为中性气体分子密度，q为离子所带电荷量，β为分析池的几何参数[40]，Vpp为RF激发幅值，texc为激发持续时间，d为分析池的直径。实验中使用Xe作为碰撞气，测量离子CCS时的背景气压设置为大于1.33×10-4Pa，并成功测量了冠醚的CCS，示于图2。Yang等[43]对比了该方法与以He为缓冲气使用漂移管离子淌度谱测量的离子CCS数值，测试了几种不同中性碰撞气体在较高能碰撞中离子CCS测量的性能，发现相对分子质量较低且单原子分子作为碰撞气的效果最佳(如Ar)。

为了使实验结果更具对比性，Anupriya等[44]对比了FT-ICR MS法与漂移管离子淌度谱的测量结果，发现在2种不同仪器中测量20种生命必需氨基酸的质子化离子CCS的结果有一定偏差，但都呈现出离子CCS数值随分子质量增大而增大的特点，示于图3a。使用不同类型仪器测量的离子CCS存在偏差，主要是由于CRAFTI方法使用的硬球碰撞模型不适用于较高能量的碰撞。目前FT-ICR MS具有较强的磁场以及较低的背景气压，离子的动能更高。同一研究小组在对数据重新分析后认为，需要对线宽乘以参数π[45]。因此，离子CCS的计算方法应由式(1)修正为式(2)：

(2)

修正后的理论模型与Xu等[46-47]使用的方法一致。使用新的物理模型重新测量20种氨基酸的CCS发现，测量值与使用离子淌度仪得到的结果更接近，示于图3b。

由于上述理论模型中的关键参数n(中性分子密度)与ICR分析池的背景气压密切相关，精确测量离子CCS的前提是精确读取气压值，但由于FT-ICR MS结构的限制，ICR分析池被巨大的超导磁体包裹，真空规通常安装在距离分析池中心较远的地方，导致检测到的背景气体压力值存在较大偏差。基于上述问题，Pope等[48]使用内标法测量离子的CCS，同时激发多种不同质荷比的离子，并使用其中1种已知CCS的离子作为内标，消除了由于压力检测不准确给离子CCS测量带来的偏差。具体计算方法示于式(3)：

(3)

式中，下标为1和2的变量分别与已知、未知CCS的离子相关。

2.1.2峰宽校正法 直接使用质谱峰线宽方法要求碰撞气的压力相对较高，测量离子CCS时通常使用1.33×10-4Pa的压力，与目前FT-ICR MS的标准工作气压(1.33×10-8Pa)相差4个数量级。在标准工作气压条件下，中性气体的分子数量相对较少，碰撞概率比高气压状态下降低很多，所以质谱仪检测到的信号强度衰减速度会较慢。将时域信号转换为频域信号需要由傅里叶变换来完成，但将有限时间内的时域信号做傅里叶变换会因窗口效应[49-50]而造成测量线宽与理论线宽的误差，而且开窗时间越短产生的误差越大，示于图4a～4d。因此，Jiang等[47]开发了一种线宽校正方法来消除窗口效应产生的误差。离子的CCS(σ)可根据式(4)计算：

注：a.时域信号；b.频域谱图； c.不同Xe分子数量密度下的频域半峰宽图2 不同Xe压力下18-crown-6·Cs+的 FT-ICR线宽[40]Fig.2 Variation of FT-ICR line width for 18-crown-6·Cs+ complex under different Xe pressures[40]

注：a.模型校正前[44]；b.模型校正后[45]图3 CRAFTI方法与离子淌度谱测量20种必需氨基酸CCS值Fig.3 CCS values of 20 biogenic amino acids based on CRAFTI method and IMS

(4)

2.1.3频域谱线拟合法 与2.1.2节的频域线宽校正法相比，频域谱线拟合法的抗干扰能力更强，该方法是一种基于频域谱峰测量离子CCS的方法，通过单个质谱峰的峰型变化来拟合离子电流的衰减因子[51]。在实际的FT-ICR MS实验中，采集时域电流信号时只能采集到无限长信号的一小部分，这就会由于窗口效应影响频域的谱峰峰型[52]。通过式(5)计算理论峰型，利用最小二乘法评估拟合效果。

{1-2e-cTcos[(ω-ω0)T]+e-2cT}1/2

(5)

式中，N0为1次检测中的离子数量，ω0为离子的回旋频率。通过式(5)即可计算得到电流衰减因子c，再根据高能硬球碰撞即可计算离子的CCS[38]。

2.2 时域分析方法

FT-ICR MS采集的镜像电流是一种时域信号，所以信号的衰减可从时域中计算得到，还可从时域信号中分离出不同异构体的信号，这在频域分析方法中无法实现。Mao等[46]提出了衰减曲线拟合法，该方法基于时域信号的数据提取目标离子的衰减曲线，是目前主要的时域分析方法，其流程示于图5。该方法的关键在于利用轮廓线提取算法获取目标离子的指数衰减率常数c，再通过式(6)计算离子的CCS。

(6)

式中，P为缓冲气压力，k为玻尔兹曼常数，T为温度，B为磁场强度，r为离子回旋轨道半径，m/z为目标离子的质荷比。使用衰减曲线拟合法，Mao等[46]测量了不同价态泛素蛋白质离子的展开构型，并精准测量离子的CCS。该方法的不足之处是需要引入的拟合参数较多，数据运算量较大。

2.3 时频分析方法

2.3.1希尔伯特变换法 Li等[53]使用希尔伯特变换方法取代快速傅里叶变换(FFT)处理质谱仪的时域数据，并获取镜像电流的指数衰减系数，计算离子CCS。这种方法可以解决时域衰减曲线拟合法[46]数据运算量大的问题，可对离子瞬态数据直接在时域上进行时频分析，提取离子的运动频率并获取离子随时间变化的衰减曲线，最终基于衰减率常数c根据式(6)计算离子的CCS。

图4 无限长时域信号(a)及其吸收模式频域谱图(b)，6 s时域信号(c)及其吸收模式频域谱图(d)， 在FT-ICR MS和IMS上测量几种生物分子离子CCS的结果相关性(e)[47]Fig.4 An infinitely long time-domain signal (a) and its absorption-mode frequency spectrum (b), the same timedomain signal weighted by a 6 second truncation window (c) and its absorption-mode frequency spectrum (d), CCS obtained by FT-ICR MS versus the results from IMS (e)[47]

图5 时域信号处理的流程图[46]Fig.5 Schematic flowchart for the time domain data processing[46]

2.3.2短时傅里叶变换法 Hu等[54]利用短时傅里叶变换(STFT)方法提取离子信号强度的指数衰减率常数，并基于硬球碰撞模型计算离子CCS。这一方法首先将FT-ICR MS镜像电流的时域信号按照相等的时间长度进行重叠开窗，尽可能消除短时傅里叶变换因窗口效应而造成的信号失真；其次使用FFT方法将每个短时间窗口内的时域信号转化为频域信号，即可得到每个时间窗口的频域信号；然后以时间为横坐标，频域信号强度为纵坐标，对其衰减曲线进行拟合，并根据式(7)通过线性校正计算离子CCS：

(7)

式中，D为该工作中所设变量，m为待测目标物的质量，M为缓冲气的质量，T为温度，k为玻尔兹曼常数，r0为离子初始半径，q为离子所带电荷量，B为磁场强度，P为背景气压力。实验中需要结合仪器条件，利用标准样品对离子的CCS进行线性校正。Hu等[54]使用该方法在9.4 T的FT-ICR MS仪器上(在9.0 T的磁场强度下开展实验)实现了石油中混合酸和多聚丙氨酸等小分子CCS的测量。这一方法较轮廓线提取方法更方便，但选择窗口的宽度会对结果产生一定的影响。

2.4 不同数据分析方法的对比

使用FT-ICR MS仪器测量离子CCS的3种数据分析方法列于表2。频域分析法具有简单、直接的优点，但无法区分异构体。时域分析法需要处理的数据量大，拟合时引入的参数较多。时频分析法结合了上述2种方法的优点，可在1次检测中测量多个不同质荷比离子的CCS，在时域信号中捕捉离子的瞬间变化状态并获得镜像电流的衰减曲线，但计算量相对较大。

表2 不同数据分析方法的对比Table 2 Comparison of different data analysis methods

3 FT-ICR MS测定离子CCS方法的应用

3.1 化合物离子的CCS测量

在FT-ICR MS测定离子CCS的应用方面，Yang等[40]使用“频域峰线宽直接计算法”测定了多种环状分子(冠醚、环糊精等)-碱金属化合物离子的CCS。该实验使用氙气作为缓冲碰撞气，在1台4.7 T FT-ICR MS仪器上完成。通过对比实测数值与理论计算数值，可以发现很多化合物的实验测定值与理论计算值存在较大差异，但总体增长趋势基本相同。产生这种结果的原因可能有2种：1) 实验中使用的碰撞气为相对分子质量较大的氙气，而仿真数据则是基于相对分子质量很小的氦气；2) 方法建立初期主要使用的是适用于低能量离子-中性碰撞的硬球碰撞模型，该理论模型不完全适用于实验中的碰撞环境。从数值上可以看出，较小分子的实验数值与理论数值相对接近，但随着分子尺寸增大，理论与实验间的差异被不断放大，该团队在其之后的研究中也对理论碰撞模型进行修正并得到较准确的测定结果[45](图3)。除此之外，Hu等[54]使用STFT方法基于硬球碰撞模型测定了石化产品中一些小分子化合物的CCS。

3.2 ICR分析池内压力的间接测定

通常，真空规直接检测的位置与ICR分析池中心之间存在一定距离，这导致测定的压力数值不能体现出ICR分析池内真实的环境压力。而离子CCS为离子所具有的自然属性，理论上，在温度、激发方式等条件相同的情况下应为常数。基于以上论述，根据式(6)在控制仪器条件的前提下只需测定出1个已知CCS的离子信号衰减率就可以推测出ICR分析池内真实的压力值，在此情况下所有变量都可视为常数，所以衰减率系数和压力是简单的一次线性关系。上述方法可以利用离子CCS这一固有参数，在不需增加任何仪器硬件装置的前提下，仅凭仪器信号的处理即可实现分析池内真实压力的准确测定。

基于上述原理，Pope等[48]在不同的ICR分析池气压条件下对离子进行激发，结果示于图6a。离子时域信号强度的衰减速率会随气体压力的增大而提高，示于图6b；频域信号峰的半峰宽因背景压力的提高而展宽，示于图6c。根据频域峰宽可以得到ICR分析池内背景气体的中性气体密度，进而计算出实际的气压数值。中性气体密度与离子频域峰的半峰宽成一次线性关系，示于图6d。

3.3 基于离子CCS的光谱分析方法

基于FT-ICR MS测定离子CCS的方法可与光活化串联质谱分析相结合，通过扫描不同波长的激光可以得到全新的光谱图。在最近的一项研究中，Zhou等[55]基于1台7.0 T 的FT-ICR MS仪器，结合调谐激光，并使用STFT数据处理方法，首次提出了一种全新方法应用于蛋白质离子的去折叠光谱响应研究，并称之为“光去折叠化光谱”或“光异构化光谱”，这种光谱图以扫描激光的波长为横坐标，以质谱时域信号的衰减率系数(或离子的碰撞截面积)为纵坐标。此研究中基于STFT方法的数据处理原理流程示于图7a，基于高能硬球碰撞模型，根据式(8)计算离子的CCS：

(8)

注：a.ICR分析池中的离子-中性碰撞；b.不同气压条件下离子的时域信号； c.不同气压条件下离子的频域信号；d.频域信号半峰宽与中性分子密度之间的线性关系图6 间接测定ICR分析池内压力的原理图[48]Fig.6 Schematic diagram showing the processes of indirect measurement for ICR cell pressure[48]

图7 [Cyt c+13H]13+离子信号在激光关闭和开启状态下STFT时域信号数据处理方法的原理流程图(a) 以及离子[Cyt c+13H]13+(b)和[Cyt c+15H]15+(c)的光去折叠化光谱图[55]Fig.7 Schematic diagram showing the processes to find the difference between the two CCSs of the target ions of [Cyt c+13H]13+ with and without the laser irradiation (a), photon unfolding spectra of [Cyt c+13H]13+ (b) and [Cyt c+15H]15+ (c)[55]

式中，pe为校正因子，其数值在相同的检测条件(压力、离子激发、离子检测参数)下是相同的，其他变量的定义与式(6)相同。Zhou等[55]利用该方法获得了细胞色素c的[Cyt c+13H]13+和[Cyt c+15H]15+离子的光异构化光谱，示于图7b、7c。可以看出，信号的衰减率系数会因受到不同波长激光的照射而改变，这是因为在不同波长的激光照射下，离子吸收光子后发生了异构化，并呈现出不同的构象，离子的CCS也会随之改变。

4 总结与展望

目前，基于IMS的离子CCS测量方法已相对成熟，该方法可分离同分异构体并检测其CCS，具有分辨率高、灵敏度高、直接测量无需校正等优点，可在大气压环境中实现检测。基于FT-ICR MS的离子CCS测定技术在近10年内被逐渐发展并得到初步应用，无需改变仪器条件即可获取离子的CCS，但其受实验条件影响较多，测量结果波动范围较大，且离子CCS的测定需要其他方法的校准，目前仍处于研究阶段。该方法主要使用郎之万碰撞模型、硬球碰撞模型和高能硬球碰撞模型等3种碰撞模型。郎之万碰撞模型和硬球碰撞模型主要适用于低离子动能-小分子质量的场景；高能硬球碰撞模型适用于高离子动能-大分子质量体系。基于频域信号、时域信号以及时频分析是3类主要的数据处理方法，虽基于相同的物理学基础，但各具特点。随着FT-ICR MS仪器和信号处理技术的发展，将会开发出检测精度更高、使用范围更广的数据分析方法，以提供更多独特的分子结构信息。目前，FT-ICR MS已应用到仪器真空度的检测及气相离子光谱分析等领域，未来可为仪器科学、分析化学、物理化学等领域的研究提供新的解决途径。