利用废弃碳资源生产鼠李糖脂的研究进展

刘仕勋, 刘豪杰, 周 杰, 徐 宁, 信丰学, 董维亮*, 姜 岷

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室,江苏 南京 211816;2.淮阴师范学院 化学化工学院,江苏 淮安 223300)

表面活性剂是一类能显著改变表面/界面性质的重要精细化学品，广泛用于石油、日用化学品、食品、医药工业等领域，被誉为“工业味精”。随着人们生态环保意识逐渐增强，表面活性剂的“绿色化与功能化”逐渐成为了行业发展的主题，生物表面活性剂的研究、开发和应用受到了越来越多的关注[1]。在已发现的生物表面活性剂中，鼠李糖脂以其结构多样、性能优异的特点获得了更多的关注，是目前研究最为深入、功能性最强的一种糖脂类生物表面活性剂，具有广阔的发展前景。研究表明，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)能够利用多种不同的碳源为底物发酵生产鼠李糖脂，包括水溶性碳源(如甘油、葡萄糖、甘露醇等)和不溶性底物(如植物油、烷烃等)[2-3]。

随着化石资源的大量使用和人类社会的发展，工业、农业和林业废弃物的过度积累已经严重威胁到我们赖以生存的环境和身体健康，如何解决废弃碳资源再利用的问题对保护自然环境和人类健康至关重要。广义上废弃碳资源再利用指的是以废弃生物质、CO2和废弃塑料等为原材料，合成高附加值化学品、能源和材料等，在原料层面实现“负碳”排放，不仅有助于解决废弃碳资源污染浪费的问题，同时能缓解当前生物制造以糖类作为生产原料的“与民争粮、与粮争地”的问题。废弃碳资源再利用作为循环经济的重要组成，关乎环境保护与经济发展，是助力实现“碳中和”目标的关键技术之一。因此，合理利用废弃碳资源，并将其转化为有价值的产品，是解决废弃碳资源问题的关键。而鼠李糖脂作为一种微生物发酵产品，可利用低劣碳资源进行绿色生产，同时鼠李糖脂本身无毒且生物可降解，不会造成二次环境污染，是一种优质的废弃碳资源转化产品。作者将以废弃油脂、含糖废料和废弃塑料高聚物为主要研究对象，综述当前以废弃生物质及其他碳资源作为原料发酵生产鼠李糖脂的研究进展，分析鼠李糖脂生产的瓶颈和发展方向，并论证了鼠李糖脂作为废弃资源循环经济中核心产品的可行性。

1 概 述

鼠李糖脂是一种极具发展潜力的生物表面活性剂，具有较高的工业附加值。以工、农、林业废弃碳资源等为原料生产鼠李糖脂，不仅有助于解决废弃碳资源浪费问题，还实现了向高值化产品的转化；既降低了鼠李糖脂生产成本，又实现循环经济、生态保护等多重效应(图1)。

图1 废弃碳资源生产鼠李糖脂过程概览

目前，有潜力作为发酵底物生产鼠李糖脂的废弃碳资源主要有三类：废弃油脂、含糖废料和废弃塑料高聚物。常见的废弃油脂主要来自食品加工厂的副产物和餐饮废油[4]。由于铜绿假单胞菌等鼠李糖脂的生产菌株通过β-氧化降解油脂的能力较强，且油脂的降解产物如脂肪酸等可以直接参与到鼠李糖脂合成途径中[5]，所以富含脂肪酸、三酰甘油和脂溶性烃等营养物质的废弃油脂是最适用于鼠李糖脂的发酵生产。因此，研究人员在利用废弃油脂作为底物发酵生产鼠李糖脂方面进行了尝试[6]。含糖废弃物作为制糖工业、农业和林业生产过程中产生的副产物，产量巨大且价格低廉，也是可以用于鼠李糖脂发酵的原材料。除此之外，废弃塑料高聚物的降解产物中也含有许多可以被微生物转化利用的组分，这些组分理论上也可以用于合成鼠李糖脂。同时，鼠李糖脂因其优秀的表面活性和可降解性，可作为废弃碳资源高值转化的产品，因此，废塑料等碳资源的降解生产鼠李糖脂也是一种具有发展潜力的循环经济模式。

2 以废弃碳资源生产鼠李糖脂

2.1 废弃油脂发酵生产鼠李糖脂

2.1.1含油废水 含油废水的来源非常广泛，如橄榄油、大豆油、葵花子油等油脂生产企业都会产生含有废弃油脂的废水，通常都作为废弃物。地中海国家每年产生约200～300万吨含油农业废水，其中主要以橄榄油厂废水(OOME)为主。1993年，Mercadé等[7]就已开始尝试借助假单胞菌(Pseudomonassp.)菌株降解橄榄油厂加工废水中的油脂来生产鼠李糖脂。Sidal等[8]通过假单胞菌属菌株(P.sp. A01)在含有10%的OOME和硝酸钠的无机盐培养基中生产鼠李糖脂，72 h能获得115 mg/L的鼠李糖脂。此外，Fazli等[9]以施氏假单胞菌(P.stutzeriBK-AB12)为生产菌株，也成功在以棕榈油厂废水(POME)为碳源的无机盐培养基中获得鼠李糖脂。Benincasa等[10]将葵花籽油生产过程中产生的皂脚和酸性废水作为底物，通过菌株P.aeruginosaLBI生产获得了7.3 g/L的鼠李糖脂。然而，由于油脂本身与水的相容性差，含油废水中营养有限，作为底物时需要添加其他可溶性碳源共同为鼠李糖脂生产提供原料。在生产实践中，利用含油废水中的废弃油脂生产鼠李糖脂，可以有效降低废水COD，这既是一种有效的环境污染处理方案，又可以实现废弃资源再利用，从而提高经济效益。

2.1.2食品加工废油 油类和脂肪是食品加工行业的重要原料，食品加工生产过程中产生了大量含油脂的废弃物，虽然由于相关行业的原料不同、产品不同等，其含油脂的废弃物组分存在一定差异[11]，但均可以废料资源化用于生产鼠李糖脂，只是与其他碳源相比，植物油是生产鼠李糖脂的优质碳源，更适合用于鼠李糖脂的发酵生产[12]。部分以废弃油脂为原料生产鼠李糖脂的研究具体见表1。Abalos等[13]以大豆油厂含油废弃物为原料，使用P.aeruginosAT110进行发酵，发酵96 h可以获得9.5 g/L鼠李糖脂。Raza等[14]将菜籽油压榨过程中产生的废料，通过P.aeruginosaEBN-8突变菌株发酵，最高能合成8.5 g/L的鼠李糖脂。除了植物油脂可以直接用作发酵原料以外，在植物油脂精炼过程中会产生一种含油副产品皂脚，其也可以作为发酵原料，约占油脂生产总量的2%～3%。Nitschke等[15]以大豆皂脚为底物，发酵144 h能得到11.7 g/L的鼠李糖脂，底物转化率达到75%。Lotfabad等[16]使用菌株P.aeruginosaMR01，在添加80 g/L的大豆皂脚作为底物的情况下，鼠李糖脂产量达到25.5 g/L。

此外，除了植物油厂加工过程中产生的废油，水果加工厂也是含油废弃物的重要来源。以芒果为例，作为世界上第二大产量的热带水果作物，全球每年以芒果仁为原料可以生产超过12.3万吨的芒果仁油[29]，但是目前芒果加工后的果仁往往被当做废物简单处理，并没有得到有效再利用。Reddy等[17]尝试使用压榨芒果仁油和葡萄糖作为混合碳源，发酵120 h可获得2.8 g/L的鼠李糖脂。除了植物油脂之外，食品加工过程中的动物脂肪也是废弃油脂的重要之一。Sana等[18]以废弃的卡特拉鱼脂肪为底物发酵72 h，可以得到1.386 g/L的鼠李糖脂，证明动物油脂同样可以用作鼠李糖脂发酵的底物。因此，各种来源的含植物油脂的废弃物都可以作为鼠李糖脂发酵原料，由于菌株的底物偏好性、发酵条件不同等因素的影响，不同来源的食品加工废油作为原料生产鼠李糖脂的产量差异较大，总体上植物油脂相比动物油脂等更适合用于鼠李糖脂的发酵生产。

2.1.3餐厨废油 餐厨废油通常指包含煎炸废油、潲水油和地沟油等在内的，来源于餐饮行业和家庭厨余的废弃油脂[30]。国际上对餐厨废油定义表述略有不同，一般指经过高温处理的废弃食用油(WEO)，如油炸废油(WFO)和烹饪废油(WCO)。废弃食用油相对广泛，本文暂且将其相关内容归类于餐厨废油。据统计，2020年我国餐厨废油产量超过1 000万吨[31]。目前，我国对于餐厨废油的回收利用、检测方法和相关规章制度并不完善，多采用将餐厨废油回收后作为化工原料和家畜饲料的方式处理，但这些方式不可避免存在二次污染的问题，而且会将有害物质引入食物链[31]。目前，很多研究报道了通过利用餐厨废油生产鼠李糖脂的工艺，其产量从1.12 g/L到13.93 g/L不等(表1)。除了直接生产鼠李糖脂以外，鼠李糖脂等生物表面活性剂的存在还可以强化微生物对厨余垃圾的降解能力。Zhang等[32]将无细胞的鼠李糖脂发酵液添加到有氧活性污泥系统中进行煎炸废油的降解，30 h降解率达90%。Fu等[33]考察了鼠李糖脂对厨房垃圾中有机质有氧降解的影响，发现鼠李糖脂的添加减缓了底物中水的蒸发，显著增强了有机物在底物水相中的分散，加快了有机质的降解。考虑到餐厨废油低廉的价格和巨大的产量，将其作为发酵底物，通过微生物发酵可以生产高附加值的鼠李糖脂，同时得到的鼠李糖脂可以提高微生物对厨余垃圾的降解效率，因此这可作为一种经济环保且具有工业化应用潜力的处理方式[34]。

表1 以废弃油脂为底物发酵生产鼠李糖脂的研究现状

2.2 含糖废弃物发酵生产鼠李糖脂

2.2.1含糖的食品加工副产物 糖蜜是制糖和酿酒等工业的副产物，主要由糖类组成，由于原料不同，其组分差异较大，分为甘蔗糖蜜、大豆糖蜜、甜菜糖蜜等[35-39]，可作为碳源供给微生物发酵生产鼠李糖脂(表2)。Patel等[37]用P.aeruginosaGS3在含大豆糖蜜的培养基上制得0.24 g/L的鼠李糖脂。Onbasli等[38]选取甜菜糖蜜为唯一碳源，使用浅黄假单胞菌(P.luteolaB17)可以合成 0.53 g/L 的鼠李糖脂。Azran等[39]使用糖蜜和糖液作为唯一的碳源，通过从海洋沉积物中分离的P.aeruginosa合成了3.4～3.9 g/L的鼠李糖脂。目前，糖蜜为底物合成鼠李糖脂的最高产量是由P.aeruginosaATCC 10145实现的，发酵后可以获得11.7 g/L的鼠李糖脂[40]。除糖蜜以外，含糖的固体残渣也可以用作发酵底物，如以压榨后的甘蔗渣为底物共培养P.aeruginosa和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，可以合成9.1 g/L的鼠李糖脂和8.4 g/L的乙醇[41]。

除了制糖工艺产生大量糖蜜外，酿酒行业也会产出大量的糖蜜和含糖废水。Li等[42]使用酒厂糖蜜废水作为底物，通过P.aeruginosaGIM32成功合成2.6 g/L鼠李糖脂。P.aeruginosastrain BS2也被报道可以利用酿酒厂废料和葡萄糖作为底物合成0.92 g/L鼠李糖脂[43]。

此外，乳制品行业产生的废弃乳清中含有乳糖和蛋白质，也可作为微生物的碳和氮的来源(表2)。P.aeruginosaSR17能够在乳清为原料的培养基上生产2.7 g/L鼠李糖脂[44]；当在透明乳清培养基中加入2%的葡萄糖和无机盐时，产量进一步提高到4.8 g/L。也有研究表明：以富含乳糖的生奶酪乳清作为底物，P.aeruginosaATCC 10145可72 h生产9.6 g/L的鼠李糖脂[45]；此外，豆腐生产过程中的乳清废水也可以作为鼠李糖脂合成的底物[51]。

表2 以含糖废弃物为底物发酵生产鼠李糖脂的研究现状

食品加工等轻工业产生的糖蜜等副产品由于含糖量高，很适合作为微生物发酵的底物。然而，由于鼠李糖脂分子是由糖基和脂肪酸链两部分组成，糖类底物只能通过从头合成途径合成脂肪酸链，供给单一，很难保证鼠李糖脂合成的效率[43]。因此，利用含糖的食品加工副产物合成鼠李糖脂可能需要诱变育种和代谢工程等手段的协助，从而进一步提高糖蜜等底物合成鼠李糖脂的生产效率。

2.2.2含糖果蔬废弃物 据统计，我国每年产生的果蔬废弃物有1亿吨，大部分未进行资源化处理，对生态环境造成了严重影响[52]。果蔬废弃物(如果皮和果渣等)中糖类约占有机质干质量的75%，很适合作为微生物发酵底物(表2)。George等[46]通过菌株P.aeruginosaMTCC 2297对多种农业废料进行发酵对比，发现以橙皮作为碳源可合成9.18 g/L的鼠李糖脂。果蔬废弃物虽然产量大、含糖量高，但是由于其极易腐烂和pH值较低等原因，目前以其为原料生产鼠李糖脂的相关报道较少，生产实践中直接用于鼠李糖脂发酵生产还存在一定困难，需要进一步研究。

2.2.3木质纤维 木质纤维是地球上最丰富的可再生资源[53]，含丰富的六碳糖和五碳糖(如纤维素中的葡萄糖，半纤维素中的木糖和阿拉伯糖)，均以高聚物的形式存在，不能直接作为底物被假单胞菌利用。因此，木质纤维需要经过预处理，将高聚物变成单糖或低聚糖才能作为底物用于发酵生产鼠李糖脂(表2)。Prabu等[47]使用硫酸、磷酸和氨预处理小麦秸秆，然后用纤维素酶水解获得糖液作为底物，利用P.aeruginosaNCIIM 2036发酵生产了9.38 g/L的鼠李糖脂。Ozkan等[48]将大麦浆等含木质纤维的废物用于生产鼠李糖脂，其产量达到2.4 g/L。该研究发现如果在培养基中添加甘油，可使产量大幅度提高，达到9.3 g/L。Cedap等[49]使用椰子纤维水解液和甘油作为碳源进行发酵，可获得0.57～1.25 g/L的鼠李糖脂。张媛等[50]以玉米秸秆稀酸解液为底物，并进行氮源和发酵条件优化，使用菌株P.aeruginosaPC-1进行发酵，最终获得19.3 g/L的鼠李糖脂。目前，鼠李糖脂发酵菌株均无法直接降解利用木质纤维，若想实现发酵体系内木质纤维的降解并转化合成鼠李糖脂，需要多酶(纤维素酶、半纤维素酶)体系或者混菌体系的共同作用。另外，研究表明[54-56]：鼠李糖脂作为辅助添加剂可以提高纤维素酶的稳定性和活性，这为多酶和混菌体系下提高木质纤维降解效率，进而开展鼠李糖脂发酵生产提供了新的研究思路。

2.3 以废塑料等废弃高聚物为原料合成鼠李糖脂

随着化学工业技术的发展，人工设计的新型石油基高分子聚合物不断涌入人类社会，伴随而来的是日益增长的“白色污染”问题。以塑料为例，2019年全球塑料产量达3.68 亿吨，相比 2018年增加900万吨,废弃的塑料大部分被焚烧或填埋[57]；还有大量的微塑料流入海洋，通过食物链进入人们的餐桌，严重威胁着人类的健康[58]。当前废弃塑料的回收主要是以物理回收和化学回收为主，但这两种回收方式都存在二次污染的问题，所以具有环境友好性的生物降解处理法越来越受到关注。废塑高聚物降解产物复杂多样，分离纯化难度大，再利用成本高，并不适合直接作为化学成品或半成品进入人类社会。因此，如何实现废塑高聚物的降解并完成转化继续服务人类社会是一个难题。

废弃塑料作为人类社会最常见的废弃高聚物，对人们社会生活和自然环境产生了深远影响。如何解决废弃塑料污染的问题，同时将其转化为高附加值的产品成为当前的研究热点。2015年，欧盟提出了针对塑料生物降解和高值化利用项目——欧盟地平线2020塑料生物降解及利用项目P4SB，旨在打通塑料降解物生物炼制的技术路线，主要以生物可降解塑料(PHA)和鼠李糖脂为目标产物开展了一系列的研究[59-60]。2019年，国家自然科学基金委和欧盟委员会共同资助了“合成塑料降解转化微生物菌群”方向的2个高强度国际(地区)合作与交流项目并展开实质性研究[61]。由于废弃塑料解聚后的产物中含有大量有机酸、有机醇、芳香类化合物以及脂肪烃化合物，这些产物大都可以被鼠李糖脂生产菌株利用，进而可以转化合成鼠李糖脂。此外，鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂，可以协助微生物利用废弃塑料的解聚产物中疏水性组分，提高塑料生物降解和转化利用效率[62-64]，且不会对环境造成二次污染。近期，相关研究证实了该技术路线的可行性，德国研究人员基于恶臭假单胞菌(P.putidaKT2440)构建了脂肪酸代谢工程菌株(A12.1p pPS05)、 1，4-丁二醇代谢突变菌株(B10.1 pPS05)和乙二醇代谢工程菌株(ΔgclRΔPP_2046ΔPP_2662 ∶ ∶14d)(图2)，分别利用聚氨酯(PU)的解聚产物己二酸、 1、 4-丁二醇和乙二醇为底物成功转化合成0.02，0.13和0.29 g/L的鼠李糖脂[65]。目前，以塑料解聚产物为底物生产鼠李糖脂主要受限于较低的合成效率，需要进一步构建高效的塑料解聚单体代谢和鼠李糖脂合成途径，并引入多酶/混菌体系增强降解利用效果和转化效率，实现“降塑再造”。

pPS05：质粒表达菌株plasmid expressing strain; rhIA:酰基转移酶acyltransferase; rhlB:鼠李糖基转移酶rhamnosyltransferase

3 存在的问题与展望

随着社会发展，人类活动产生了大量的废弃碳资源，不仅污染了生态环境，也造成了严重的资源浪费。然而，由于废弃碳资源种类繁多，性质差异巨大，传统回收利用成本高且难度高，如何处理这些废弃资源一直以来困扰着人们。鼠李糖脂是一种高附加值的生物表面活性剂，无毒、可生物降解，可以以多种碳资源为原料进行合成，十分适用于解决废弃碳资源的再利用问题。同时，鼠李糖脂由于其生物表面活性剂的特性，可广泛应用于如餐饮废油等废弃碳资源的降解，作为下游转化利用后的产品反馈协助上游废弃碳资源处理，促进废弃碳资源循环经济的发展。迄今，利用废弃碳资源发酵生产鼠李糖脂主要还处于研究阶段，其工业化生产仍面临诸多挑战。目前存在的问题主要有：1) 回收分类程度低，大部分废弃碳资源回收率低，分类处理困难，除餐饮废油等含油脂废弃物外，其他废弃碳资源难以直接作为微生物发酵生产鼠李糖脂的底物，需要对其进行预处理；2) 废弃碳资源种类繁多、组成复杂，而发酵菌株对底物偏好性较高，很难使用单一菌株高效利用各组分，制约了回收效率和鼠李糖脂生产效率；3) 废塑高聚物等碳资源结构稳定，很难直接通过微生物降解，而且塑料解聚产物中存在不少难以被鼠李糖脂生产菌株代谢利用的成分，作为底物生产鼠李糖脂难度大。

针对上述问题，作者认为废弃碳资源再利用生产鼠李糖脂的研究将集中在以下3个方面：1) 规范废弃碳资源回收管理。完善废弃碳资源回收相关规章制度，鼓励农业、林业、工业和餐饮业废弃物的回收分类，推动企业规模化、标准化和产业化处理，形成稳定的鼠李糖脂生产底物供应链；2) 提高多底物发酵生产鼠李糖脂利用效率。强化单一菌株糖类等底物合成鼠李糖脂的代谢流。构建多酶、多菌复合体系，研究混菌体系中菌株间互利共生关系与适配机制，提高糖类等废弃碳资源再利用效率和鼠李糖脂合成产量与产率；3) 鼠李糖脂生产菌株的选育及代谢工程改造。借助菌株诱变技术和高通量筛选技术筛选具有高效底物降解能力的鼠李糖脂生产菌株。运用基因编辑和合成生物学等的相关理论和技术，对生产菌株进行代谢工程改造，选择合适的底盘微生物构建人工细胞工厂，并引入混菌体系强化废塑高聚物的解聚和代谢，强化废弃碳资源底物利用和鼠李糖脂合成，构建适用于工业化生产的鼠李糖脂生产菌株或菌群。

利用废弃碳资源生产鼠李糖脂符合绿色生物制造的发展理念，具有广阔的发展空间，目前还需对各类碳资源发酵生产鼠李糖脂进行系统性分析和评估，加强理论基础研究的深度和规模生产等有效数据的积累，建立完备的废弃碳资源再利用生产鼠李糖脂的技术体系，推动废弃碳资源循环经济的发展。